隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及新的組裝工具的不斷開發(fā)應(yīng)用，基因組denovo測(cè)序及組裝進(jìn)入了Genomic2.0時(shí)代，我認(rèn)為Genomic2.0時(shí)代的標(biāo)志有兩點(diǎn)：1. 三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序及Hi-C測(cè)序技術(shù)在基因組denovo測(cè)序上的用；2.組裝方法上，Canu和Hifisam等工具不斷被開發(fā)應(yīng)用出來，有的工具極大的降低了算力要求，有的工具能夠?qū)⒒蚪M組裝到單體型水平，也就是將同源或非同源的兩套多套染色體分別組裝出來，因此，最近幾年，不僅很多物種的基因組被公布，而早些年間即使被公布了的基因組，也都利用新的測(cè)序及組裝策略進(jìn)行了更新。今天我先學(xué)習(xí)Hifiasm工具。

一.Hifiasm工具簡(jiǎn)介:

Hifiasm是哈佛大學(xué)李恒團(tuán)隊(duì)提出的一種全新的單倍體基因組組裝算法, 2021年2月份發(fā)表在Nature Methods上[ref1]。它可以多線程運(yùn)行，對(duì)計(jì)算資源消耗教少，組裝快，結(jié)果準(zhǔn)確性和連續(xù)性較高。Hifiasm (Hi-C) 針對(duì)PacBio HiFi (High-Fidelity) 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了全新的設(shè)計(jì)。該算法結(jié)合了HiFi數(shù)據(jù)中精確的局部單倍型信息和Hi-C數(shù)據(jù)中的長(zhǎng)距離互作用信息以達(dá)到全局定相 (phasing)，從而獲得不依賴親本信息的染色體級(jí)別的單倍型組裝結(jié)果。為了進(jìn)一步提高組裝質(zhì)量，作者充分利用了組裝圖中的結(jié)構(gòu)信息，以及其前期研究中的Graph-binning等策略。

二．算法簡(jiǎn)介

Hifiasm組裝主要分為三步。

Step1: 測(cè)序錯(cuò)誤堿基糾錯(cuò)

盡管Hifi reads準(zhǔn)確性已經(jīng)很高了，但仍然會(huì)有部分測(cè)序(<1%)錯(cuò)誤，Hifiasm會(huì)先通過所有序列的相互比對(duì)(all vs all)，對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行糾正。在比對(duì)中，基于reads間的overlap關(guān)系，如果同一個(gè)位置的reads出現(xiàn)兩種堿基類型，且每個(gè)堿基類型至少有3條reads支持，那么這個(gè)位置會(huì)被當(dāng)作雜合位點(diǎn)，即一個(gè)SNP被保留，否則，視作測(cè)序錯(cuò)誤，將被糾正（默認(rèn)三輪糾錯(cuò)）。值得注意的是，Hifiasm只使用相同單倍型的數(shù)據(jù)進(jìn)行糾錯(cuò)，從而避免過度校正，保留來自不同單倍型的雜合變異信息。在這一步，Hifiasm可以對(duì)雜合SNP進(jìn)行定相（phasing）。

Step2: 構(gòu)建分型字符串圖（phased string graph）

根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系，構(gòu)建分型字符串圖string-graph。Hifiasm以reads作為頂點(diǎn)，一致的overlap重疊區(qū)域作為邊，保留全部的氣泡(bubble)即保留了所有的雜合位點(diǎn)（圖1），因而可以保留下來基因組上全部的單倍型信息，以便后續(xù)對(duì)于單倍型的處理。

Step3: 單倍體分型組裝

如果沒有額外的信息，Hifiasm在輸出序列時(shí)會(huì)任意選擇氣泡的一側(cè)構(gòu)建初級(jí)組裝，刪除多余的單倍體，輸出結(jié)果類似Falcon unzip和HiCanu的主要組裝結(jié)果（primary contigs）。優(yōu)于HiCanu需要依賴第三方工具去除dups序列，Hifiasm內(nèi)部實(shí)現(xiàn)了去除dups的算法優(yōu)化，簡(jiǎn)化了流程。如果有來自父母本的測(cè)序數(shù)據(jù)，Hifiasam可以利用親本特有的Kmer在圖上識(shí)別出了父母本的序列，從而得到來自父母本的單倍體基因組序列。

在基于父母本特有Kmer時(shí)，區(qū)別于TrioCanu軟件的trio-binning策略，先將三代reads區(qū)分為來自父本、母本以及部分無法區(qū)分的reads后對(duì)區(qū)分后的reads分別組裝獲得了子代的兩套單倍體序列，Hifiasm使用了graph-binning的策略對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn)。它不預(yù)先劃分reads，而是在string-graph中對(duì)reads進(jìn)行標(biāo)記。因此在一個(gè)較長(zhǎng)的bubble中，即使只有一小部分reads被正確標(biāo)記，hifiasm也可以正確地將其定相。通過這種方式，可以避免因?yàn)閞eads劃分錯(cuò)誤而引入的錯(cuò)誤位點(diǎn)和組裝斷裂，從而獲得更完整和更準(zhǔn)確的單倍體組裝結(jié)果[ref2]。

三．軟件使用

1.軟件及測(cè)試數(shù)據(jù)下載

Github鏈接：https://github.com/chhylp123/hifiasm；

下載后make編譯；

下載測(cè)試數(shù)據(jù)：

wget https://github.com/chhylp123/hifiasm/releases/download/v0.7/chr11-2M.fa.gz

2.運(yùn)行程序；

hifiasm使用時(shí)根據(jù)已有的數(shù)據(jù)分為三種模式: 2.1.只有HiFi數(shù)據(jù)(基本)模式； 2.2.有Hi-C數(shù)據(jù)的Hi-C模式；2.3.有雙親二代測(cè)序的Trio-binning模式。

2.1# Run on test data，基本模式,

./hifiasm -o test -t4 -f0 chr11-2M.fa.gz 2> test.log

awk '/^S/{print ">"$2;print $3}' test.bp.p_ctg.gfa > test.p_ctg.fa? # get primary contigs in FASTA

參數(shù)解釋：-o 輸出文件前綴， -f0 小數(shù)據(jù)使用，-t 線程數(shù)

awk提取主要的contig,這句話意思是對(duì)S開頭行處理，提取序列名稱$2和序列$3,獲得超長(zhǎng)的contig序列；

可選參數(shù)--primary: 不組裝分型,只有primary和alternate的組裝結(jié)果

運(yùn)行完成后需要關(guān)注的結(jié)果?(prefix表示前綴）：

test.bp.hap1.p_ctg.gfa: haplotype1的部分分型的contig graph;

test.bp.hap2.p_ctg.gfa: haplotype2的部分分型的contig graph;

test.bp.p_ctg.gfa (Primary assembly contig graph):主要contig的assembly graph, 對(duì)于低雜合度物種來說，優(yōu)先選擇該文件；對(duì)于高雜合度物種，該結(jié)果代表其中一個(gè)單倍型；

test.bp.p_utg.gfa(Haplotype-resolved processed unitig graph without small bubbles): 無小氣泡的單倍型解析, 在raw unitig graph基礎(chǔ)上過濾小的bubble，去掉由于體細(xì)胞突變和數(shù)據(jù)背景噪音引起的small bubbles（這個(gè)并不是真正的單體型信息），對(duì)于高度雜合基因組物種優(yōu)先選擇這個(gè)結(jié)果;

test.bp.r_utg.gfa(haplotype-resolved raw unitig graph in GFA format): 保留了所有的單倍型信息，包括體細(xì)胞突變和重復(fù)測(cè)序錯(cuò)誤；

*.bin文件：運(yùn)行時(shí)的糾錯(cuò)和相互比對(duì)的結(jié)果；

其它結(jié)果：有的網(wǎng)友還提到了一個(gè)結(jié)果，我這次沒有生成：

prefix.a_ctg.gfa(Alternate assembly contig graph)：組裝出來的另一套單體型基因組結(jié)果。

對(duì)于2.2.有Hi-C數(shù)據(jù)的Hi-C模式；2.3.有雙親二代測(cè)序的Trio-binning模式，過段時(shí)間我再跑。

四.日志信息及參數(shù)調(diào)整

通常使用默認(rèn)參數(shù)就可以，要根據(jù)日志信息判斷是否需要進(jìn)行參數(shù)調(diào)整，最主要的日志信息是Kmer圖，從而判斷hifiasm是否能夠正確的找到純合峰，雜合峰的所在位置。如果hifiasm沒有找對(duì)純合峰所在的位置，會(huì)導(dǎo)致基因組大小不符合預(yù)期，

對(duì)于雜合率高的樣本，一個(gè)常見的問題是分型的結(jié)果兩套基因組差別較大，需要為-s設(shè)置更小的值(默認(rèn)值:0.55)。

還有其它參數(shù)引用ref3，xuzhougeng的分享:

如果序列不夠長(zhǎng)，片段化明顯，則可以嘗試增加 -D 和 -N, 雖然會(huì)增加運(yùn)行時(shí)間，但是會(huì)提高重復(fù)區(qū)域的分辨率。如果后續(xù)的Hi-C，或者BioNano發(fā)現(xiàn)hifiasm組裝結(jié)果有比較多錯(cuò)誤組裝，則可以適當(dāng)降低 --purge-max, -s和 -O。或者設(shè)置 -u 關(guān)閉post-join 步驟，hifiasm通過該步驟提高組裝的連續(xù)性。

五．參考：

Ref1:Haplotype-resolved de novo assembly using phased assembly graphs with hifiasm

Ref2: https://zhuanlan.zhihu.com/p/283131167

Ref3：https://www.jianshu.com/p/6d79690dce5d?ivk_sa=1025883j

Ref4: https://hifiasm.readthedocs.io/en/latest/trio-assembly.html

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