萬(wàn)沒想到，新冠還能跟m6A結(jié)合，基于m6A甲基化的免疫調(diào)節(jié)背景，結(jié)合生信免疫浸潤(rùn)分析模塊，不僅可以量化免疫細(xì)胞亞型的豐度，還可以利用免疫檢查點(diǎn)、免疫細(xì)胞表型等熱點(diǎn)豐富結(jié)果，跟小編一起來(lái)看看文獻(xiàn)是如何分析的吧

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Frontiers in immunology （ IF: 7.561）

m6A調(diào)控因子介導(dǎo)的COVID-19患者血白細(xì)胞免疫甲基化修飾模式及特點(diǎn)

研究背景

最近的研究揭示了宿主細(xì)胞和SARS-CoV-2中m6A修飾的改變。與健康個(gè)體相比，COVID-19患者肺組織中METTL3和METTL14基因表達(dá)顯著下調(diào)，而大部分炎癥基因和胰島素刺激基因(ISGs)表達(dá)水平升高。SARS-CoV-2病毒利用宿主METTL3修飾病毒RNA并逃避宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答，SARS-CoV-2感染也被發(fā)現(xiàn)觸發(fā)m6A修飾機(jī)制重新定位并增強(qiáng)Vero和Huh7細(xì)胞中mA的豐度。盡管這些發(fā)現(xiàn)提供了宿主細(xì)胞和SARS-CoV-2之間m6A甲基組相互作用的證據(jù)，但目前的研究主要集中在幾個(gè)m6A相關(guān)基因，幾乎所有的研究都是使用模型細(xì)胞，如Caco2和Huh7，這可能不能充分反映SARS-CoV-2感染患者免疫細(xì)胞中甲基化修飾的實(shí)際情況。因此，迫切需要探索的免疫細(xì)胞中的甲基修飾譜和m6A修飾與免疫功能之間的相互作用。

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分析流程圖

數(shù)據(jù)來(lái)源

基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE157103）中126份樣本的RNA-seq，包括100例COVID-19患者和26例非COVID-19患者。獲得的臨床信息包括年齡、糖尿病狀態(tài)、ICU狀態(tài)和第45天無(wú)住院天數(shù)(HFD45)。HFD45為住院時(shí)間超過(guò)45天或住院時(shí)死亡的患者分配0值，較高的HFD45值分配給住院時(shí)間較短和疾病嚴(yán)重程度較輕的患者。

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COVID-19?患者m6A調(diào)節(jié)分子表達(dá)

分析20 m6A基因在COVID-1患者和非COVID-1患者之間的表達(dá)，可以看到所有m6a調(diào)節(jié)因子在COVID-19患者中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)；為了探索不同的m6a調(diào)節(jié)器之間的關(guān)聯(lián)，描述了三種類型的m6a調(diào)節(jié)器之間的關(guān)聯(lián)模式

COVID-19?患者免疫及富集分析

分別使用R中的“GSVA”、“clusterProfiler”包進(jìn)行富集分析，評(píng)估COVID-19患者與非COVID-19患者之間的生物功能；為了確定COVID-19和非COVID-19患者組之間的免疫系統(tǒng)是否發(fā)生改變， 通過(guò)“CIBERSORT”的細(xì)胞類型識(shí)別來(lái)確定的22個(gè)免疫細(xì)胞類型之間的兩組之間免疫細(xì)胞的豐度差異。

使用m6A分子進(jìn)行一致性聚類，確定兩種m6A調(diào)控模式

使用由“ConsensusClusterPlus”包執(zhí)行的無(wú)監(jiān)督聚類算法，根據(jù)20個(gè)基因m6A基因?qū)OVID-19患者劃分為不同的亞型，并比較感染新冠患者亞組之間這20個(gè)基因表達(dá)存在差異；找到顯著表達(dá)差異的m6A調(diào)節(jié)基因

m6A調(diào)控亞型臨床指標(biāo)及新冠患者預(yù)后相關(guān)的基因差異情況

比較不同亞組之間的住院時(shí)間HFD45，提示亞組A住院時(shí)間更短；比較亞組A和亞組B之間，新冠患者預(yù)后相關(guān)的基因（既往文獻(xiàn)報(bào)道）的表達(dá)差異情況

m6A亞型GSVA通路差異分析

GSVA分析揭示了亞型間存在代謝和免疫反應(yīng)中經(jīng)典途徑和不同生物學(xué)過(guò)程的激活。

通過(guò)LASSO回歸構(gòu)建m6A相關(guān)的保護(hù)模型

不同m6A簇之間、COVID-19患者與非COVID-19患者之間差異比較，共得到4565個(gè)共有差異表達(dá)基因。我們利用“glmnet”軟件包，在這些deg的基礎(chǔ)上構(gòu)建了患者隊(duì)列中的LASSO模型，通過(guò)lasso回歸篩選出9個(gè)候選基因。這些患者被分為兩組:訓(xùn)練隊(duì)列包括70%的患者，而驗(yàn)證隊(duì)列包括30%的患者。在訓(xùn)練隊(duì)列中構(gòu)建的模型在驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)行了驗(yàn)證。采用R包“plotROC”繪制AUC評(píng)分的受試者工作特征(ROC)曲線，評(píng)價(jià)模型的性能。

?模型評(píng)分與各種臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

模型基因富集及保護(hù)評(píng)分與臨床信息的相關(guān)性，通過(guò)模型對(duì)本研究的患者進(jìn)行打分，發(fā)現(xiàn)高低分組之間臨床指標(biāo)存在差異（賦予模型臨床意義）；保護(hù)評(píng)分與HFD45、無(wú)呼吸機(jī)天數(shù)呈正相關(guān)，與SOFA評(píng)分、APACHE-II評(píng)分、crp呈負(fù)相關(guān)。保護(hù)評(píng)分與HFD45評(píng)分(B)、SOFA評(píng)分(C)、APACHE-II評(píng)分(D)、crp (E)、無(wú)呼吸機(jī)天數(shù)(F)的相關(guān)性。

小結(jié)

本文以m6a相關(guān)分子為切入點(diǎn)對(duì)新冠患者進(jìn)行了細(xì)致的分析，首先發(fā)現(xiàn)m6A甲基化調(diào)控的3類基因在感染和未感染新冠患者血液芯片測(cè)序數(shù)據(jù)的表達(dá)水平存在差異。免疫浸潤(rùn)分析發(fā)現(xiàn)新冠患者的血液中特殊亞群免疫細(xì)胞的豐度存在異常狀態(tài)。GSVA分析發(fā)現(xiàn)患者與對(duì)照組的信號(hào)通路存在差異。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類將新冠患者分為兩個(gè)亞群，亞群之間存在不同的免疫差異。最后，將患者與非患者的差異基因和亞群之間的差異基因取交集，構(gòu)建lasso回歸預(yù)測(cè)模型，模型具有良好的診斷效能。

新冠的熱度是毋庸置疑的，本文為我們提供了一個(gè)嶄新的角度，感染新冠后患者的免疫微環(huán)境發(fā)生變化，除了m6A，缺氧，脂質(zhì)代謝，鐵死亡，焦亡，自噬等熱點(diǎn)，能否借鑒呢？你關(guān)注的疾病跟新冠有關(guān)系，這波熱點(diǎn)卻不知道該如何上車，歡迎關(guān)注我們的宮主好“eryunjian2014”，收獲屬于你的選題~