2022年3月，來自中科院遺傳發(fā)育所許執(zhí)恒團(tuán)隊(duì)和吳青峰教授在?Cell Research?雜志上合作發(fā)表了題名為“Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing”的研究論文，該研究利用單細(xì)胞 scRNA-seq 和單細(xì)胞 scATAC-seq 對(duì)人類及食蟹獼猴神經(jīng)節(jié)隆起（Ganglionic eminence，GE）的基因表達(dá)特征進(jìn)行了描述，揭示了在胚胎發(fā)育早期神經(jīng)節(jié)隆起的細(xì)胞多樣性以及發(fā)育軌跡，通過與小鼠的跨物種比較，首次確定了靈長(zhǎng)類神經(jīng)節(jié)隆起中外側(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（outer radial glia cell，oRG）的存在，最終利用單細(xì)胞 scATAC-seq 建立的人類神經(jīng)節(jié)隆起發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到了人類特異的基因及其相關(guān)的新調(diào)控途徑。該研究為大腦神經(jīng)節(jié)隆起發(fā)育調(diào)節(jié)及相關(guān)疾病的分子機(jī)制研究提供了線索。該研究中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Cell?Research【發(fā)布時(shí)間】2022年3月【影響因子】25.61【關(guān)鍵詞】單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，單細(xì)胞ATAC，神經(jīng)發(fā)育


科學(xué)問題

人腦復(fù)雜有序的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)主要由興奮性神經(jīng)元和抑制性中間神經(jīng)元組成。中間神經(jīng)元是一種高度多樣化的神經(jīng)元，具有不同形態(tài)、連接性和生物學(xué)功能的特點(diǎn)。興奮/抑制平衡障礙與許多神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)精神障礙有關(guān)，中間神經(jīng)元幾乎全部來源于神經(jīng)節(jié)隆起（Ganglioniceminence，GE），GE 可分為三個(gè)亞區(qū)，包括外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（Lateral ganglionic eminence，LGE）、內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（Medial ganglionic eminence，MGE）和尾側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（Caudal ganglionic eminence，CGE），每個(gè)區(qū)域表達(dá)特定的基因，并產(chǎn)生了時(shí)間和空間上不同的中間神經(jīng)元，有助于區(qū)域細(xì)胞多樣性和中間神經(jīng)元遷移。
在小鼠單細(xì)胞的研究已揭示了在胚胎發(fā)育過程中 GE 中間神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄特性的多樣性。然而，關(guān)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物 GE 發(fā)育過程中抑制性神經(jīng)元產(chǎn)生的研究報(bào)道很少，由于之前研究對(duì)轉(zhuǎn)錄譜分析的缺乏或質(zhì)量不高，對(duì)嚙齒動(dòng)物和靈長(zhǎng)類動(dòng)物之間的保守性和異質(zhì)性的研究仍然有限。此外，中間神經(jīng)元在發(fā)育歷程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞增殖、空間區(qū)分、譜系分化和神經(jīng)元遷移等機(jī)制仍然不清楚。

技術(shù)路線

研究技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、靈長(zhǎng)類細(xì)胞早期發(fā)育階段的細(xì)胞多樣性

研究者選用胚胎發(fā)育早期的食蟹獼猴（孕周為 7、10、12 周）和人類胎兒樣本（孕周為 9、13 周），進(jìn)行單細(xì)胞多組學(xué)檢測(cè)（scRNA、scATAC），然后混合物種進(jìn)行整合分析，得到細(xì)胞類型分群圖（圖1 A-D）。隨后文章分析了不同物種的細(xì)胞比例以及細(xì)胞類型的基因表達(dá)相似性，結(jié)果都表明人類和獼猴的 GE 細(xì)胞在細(xì)胞類型上沒有顯著差異（圖1 E、F）。隨后的軌跡推斷，則表明由 GE 祖細(xì)胞（GE progenitor）起源，并增殖生成 IPC 細(xì)胞（中間祖細(xì)胞，Intermediate progenitor），然后在 MGE、LGE 和 CGE 中分化成不同的譜系（圖1 G）。
綜上所述，結(jié)果證實(shí)了獼猴與人類 GE 的基本保守性，揭示了人類與獼猴細(xì)胞的多樣性和發(fā)育軌跡。

2、靈長(zhǎng)類 GE 祖細(xì)胞的細(xì)胞特性

隨后文章提取神經(jīng)祖細(xì)胞亞群，進(jìn)行重新聚類分析，鑒定出 RGC（Radial glia cell）和 IPC（Intermediate progenitors）（圖2 A-B）。隨后在 RGC 重聚類結(jié)果中，觀察到不同區(qū)域的祖細(xì)胞特性，NKX2-1、PAX6 和 NR2F2 分別代表 MGE、LGE 和 CGE 祖細(xì)胞（圖2 C）。

外側(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（Outer radial gliacells, oRGs）先前被證明是靈長(zhǎng)類腦容量擴(kuò)張的關(guān)鍵因素。單細(xì)胞數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn) oRGs 特定表達(dá) HOPX 基因，隨后利用免疫熒光發(fā)現(xiàn)在人、獼猴GE的腦室區(qū) VZ、腦室下區(qū) SVZ 都呈現(xiàn)HOPX 陽(yáng)性,然而，在小鼠中卻未觀察到（圖2 D）。這說明 oRGs 存在于靈長(zhǎng)類動(dòng)物的大腦發(fā)育過程中的神經(jīng)節(jié)隆起。

然后，研究者試圖找出靈長(zhǎng)類和小鼠之間 GE 祖細(xì)胞的差異。將三者數(shù)據(jù)整合在一起，建立祖細(xì)胞分群。針對(duì) HES1+?的RGC，進(jìn)行了不同物種間基因表達(dá)差異分析，證實(shí)了小鼠與靈長(zhǎng)類動(dòng)物的 RGC 差異（圖2 E）。針對(duì) IPC 細(xì)胞的分析表明，RGS16 在剛進(jìn)入有絲分裂后期的靈長(zhǎng)類和小鼠細(xì)胞中均有特異性表達(dá)（圖2 F），而 scATAC-seq 的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示，RGS16 受 PAX6、GLI3、HES5 等增殖相關(guān)基因調(diào)控（圖2 F）。這些結(jié)果暗示 RGS16 可能作為 IPC 和細(xì)胞命運(yùn)決定前體之間的過渡因子。
上述結(jié)果表明，靈長(zhǎng)類動(dòng)物在發(fā)育中的 GE 和大腦皮層中都存在 oRG，可能是靈長(zhǎng)類動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物物種差異的原因之一。

3、發(fā)育過程中 MGE 的細(xì)胞命運(yùn)

為了描述 MGE 的發(fā)育譜系，對(duì) MGE 細(xì)胞進(jìn)行重分群和軌跡重建，最終鑒定出四種不同的細(xì)胞類型，所有較成熟的細(xì)胞均有細(xì)胞粘附和軸突投射有關(guān)的基因表達(dá)（圖3 A-D）。
SST+?中間神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)涉及遷移的基因表達(dá)，提示 MGE 的 SST+?中間神經(jīng)元會(huì)向大腦皮層遷移（圖3 B）。LHX8+?細(xì)胞在早期樣本的 MGE 中檢測(cè)到，但在較后期的樣本中沒有檢出，表明 LHX8+?膽堿能投射神經(jīng)元可能在靈長(zhǎng)類大腦發(fā)育早期產(chǎn)生，與小鼠的研究結(jié)果一致（圖3 F）。
還有兩群特異表達(dá)的細(xì)胞，特征圖顯示，ANGPT2+?細(xì)胞與 LHX8+?細(xì)胞完全分離，而 CRABP1+?在一小部分 LHX8+?細(xì)胞中表達(dá)（圖3 E），進(jìn)一步的差異基因分析則發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞表達(dá)皮層PV（parvalbumin）中間神經(jīng)元前體的標(biāo)志基因，因此，研究者假設(shè)這些細(xì)胞在大腦發(fā)育過程中會(huì)向大腦皮層遷移，代表皮層 PV 中間神經(jīng)元的前體。
綜上結(jié)果，MGE 中細(xì)胞的分化較早，細(xì)胞系的多樣化具有時(shí)間依賴性，這也體現(xiàn)在 Monocle3 構(gòu)建的擬時(shí)序結(jié)果中（圖3 G-H）。

4、發(fā)育中 LGE 的細(xì)胞命運(yùn)決定

LGE 被認(rèn)為是紋狀體中間神經(jīng)元和嗅球（olfactory bulb，OB）中間神經(jīng)元的起源。因此對(duì) LGE 譜系進(jìn)行重聚類，鑒定了細(xì)胞類型（圖4 A-B）。隨后 OB 譜系的差異分析結(jié)果顯示 OB 譜系高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因，而 GO 功能分析也發(fā)現(xiàn)了 OB 中間神經(jīng)元前體存在于 LGE 的證據(jù)（圖4 C-D）。而不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞分布則表明，OB 譜系細(xì)胞主要在晚期檢出，表明 LGE 中的 OB 中間神經(jīng)元前體晚于紋狀體前體的產(chǎn)生，然后遷移到嗅球進(jìn)行進(jìn)一步增殖。

文章發(fā)現(xiàn)一組特異細(xì)胞，共享 MGE 標(biāo)記以及 LGE 標(biāo)記物，且與典型的 LGE 的紋狀體細(xì)胞不同（圖4 E），CellChat 分析發(fā)現(xiàn) SEMA3 信號(hào)通路在 LGE 組中高度激活（圖4 F），這些特異細(xì)胞表達(dá) NRP1 做出反應(yīng)，文章假設(shè)該組細(xì)胞可能來源于 MGE，并在 SEMA3 信號(hào)通路的調(diào)控下沿發(fā)育紋狀體向皮層遷移。其它高表達(dá)基因 PEG10 可以產(chǎn)生長(zhǎng)鏈非編碼 RNA 和 PEG10 蛋白，先前的研究表明，它能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移，且 MIR7-3HG 作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性 RNA，從其它 miRNA 中釋放 PEG10，而 MIR7-3HG 也在這些細(xì)胞中也是高表達(dá)，可能調(diào)節(jié) PEG10 的表達(dá)。

這些結(jié)果表明，在 GE 發(fā)育過程中，一組來自 MGE 的 LHX8+?中間神經(jīng)元沿著 LGE 遷移，并受到 SEMA3A-NRP1 信號(hào)通路和 MIR7-3HG-PEG10 通路的調(diào)控，結(jié)合擬時(shí)序分析，文章構(gòu)建了 LGE 區(qū)域的遺傳調(diào)控模型（圖4 G-H）。

5、人類 GE 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

文章還對(duì) GW9 人類樣本進(jìn)行了 scATAC-seq，基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)，對(duì) scATAC 進(jìn)行細(xì)胞類型注釋，并使用基因表達(dá)預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)了其典型標(biāo)記基因的表達(dá)水平（圖5 A-B）。ZNF503 和 LHX8 是 LGE 和 MGE 譜系的代表性標(biāo)記，scATAC 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們上游都存在染色質(zhì)開放峰，這些發(fā)現(xiàn)提示標(biāo)記基因在 MGE、LGE 中表達(dá)的可能調(diào)控機(jī)制（圖5 C）。隨后文章基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合，生成的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以確定候選轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子，PPI 分析也得到類似的結(jié)果（圖5 D-E）。

接下來，文章試圖尋找可能在 GE 發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的未知基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA9-1 宿主基因 MIR9-1 HG 脫穎而出，它在GE祖細(xì)胞和 MGE 中表達(dá)較高（圖5D），結(jié)合染色質(zhì)開放峰和 TFs 的潛在結(jié)合序列，篩選出了一些可能的調(diào)控 TFs?；虮磉_(dá)的相關(guān)分析提示，MIR9-1HG 的表達(dá)受 TCF4 的正向調(diào)控（圖5 G）。轉(zhuǎn)錄因子 ASCL1 位于 MIR9-1HG 下游，與 MIR9-1HG 在祖細(xì)胞中呈顯著負(fù)相關(guān)，而在 MGE 和 LGE 中呈正相關(guān)(圖5 H-G）。

進(jìn)一步檢測(cè)了 MIR9-1HG 潛在的下游基因。從不同的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了 hsa-mir-9-1 的靶基因，所有數(shù)據(jù)庫(kù)中均發(fā)現(xiàn)有4個(gè)基因同時(shí)受到 hsa-mir-9-1-3p 和 5p 的調(diào)控。其中兩個(gè)是 LGE 特異性 TF，ZFHX4 和 ID4，這兩個(gè)基因在 MGE 和 LGE 中的表達(dá)水平與 MIR9-1HG 呈顯著負(fù)相關(guān)（圖5 G）。

綜上，這些結(jié)果提出了 MIR9-1HG 受 ASCL1 和 TCF4 調(diào)控的新途徑。hsa-mir-9-1 可以抑制 ZFHX4 和 ID4 的表達(dá)，這可能解釋了在人類早期大腦發(fā)育過程中，MGE 和 LGE 的不同命運(yùn)是如何決定的。

總結(jié)

與嚙齒類動(dòng)物相比，尚未揭示人類 GE 中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或獨(dú)特的發(fā)育機(jī)制，因此文章通過 scRNA-seq、scATAC-seq 等技術(shù)，研究了靈長(zhǎng)類胚胎中神經(jīng)節(jié)隆起的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特性，以及在不同亞區(qū)決定的細(xì)胞命運(yùn)的可能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及細(xì)胞遷移等。在神經(jīng)發(fā)育階段，文章研究了人類和獼猴 MGE、LGE 和 CGE 的早期細(xì)胞分化和遷移，而人類和獼猴數(shù)據(jù)集之間的整合則揭示了高度保守的 GE 細(xì)胞多樣性，靈長(zhǎng)類 GE 中存在 oRG，以及人類 LGE 中一條新的調(diào)節(jié)途徑，發(fā)現(xiàn)了對(duì)人類GE 區(qū)域的細(xì)胞命運(yùn)決定具有潛在重要性的 TF，以及它們的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括可能導(dǎo)致 MGE 和 LGE 不同命運(yùn)的新調(diào)控途徑。
參考文獻(xiàn)：ZHAO, Ziqi, et al. Evolutionarily conservative and non-conservative regulatory networks during primate interneuron development revealed by single-cell RNA and ATAC sequencing.?Cell Research, 2022,1-12.
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