新年伊始，歐易生物的空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目元?dú)鉂M滿地開(kāi)工啦~ ~?~

自2020年正式開(kāi)展空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目以來(lái)，歐易生物已經(jīng)完成500+例樣本正式建庫(kù)，涉及到的實(shí)驗(yàn)物種（含植物樣本）和樣本類(lèi)型超過(guò)50例，同時(shí)也收到廣大老師們對(duì)實(shí)驗(yàn)室小伙伴優(yōu)秀貼片技巧的認(rèn)可。

隨著我們項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)的增多，小歐在這里整理出空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)中一些老師們較為關(guān)心的問(wèn)題，幫助老師們更好地了解空間轉(zhuǎn)錄組。

各位老師們還記得空間轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)流程四部曲嘛？來(lái)和小歐一起回顧一下吧！空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)四部曲分別是：樣本準(zhǔn)備，質(zhì)檢染色，透化優(yōu)化，正式實(shí)驗(yàn)。怎么樣~是不是特別簡(jiǎn)單好記呢？下面，小歐就按照這四部分的順序，分別解答老師們關(guān)心的問(wèn)題。

一

俗話說(shuō)萬(wàn)事開(kāi)頭難，空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目的開(kāi)始是樣本的準(zhǔn)備，那么我們?cè)跇颖緶?zhǔn)備方面都遇到過(guò)什么樣“難解”的問(wèn)題呢？

組織采集后，血跡比較多，是不是應(yīng)該在PBS或生理鹽水里清洗一下？

不可以哦~液體容易滲入組織，在組織冰凍或包埋時(shí)會(huì)產(chǎn)生冰晶，影響切片質(zhì)量。

先冰凍后包埋會(huì)不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果？

不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但如果組織沒(méi)冰凍好，會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷，還是建議各位老師取到組織后先包埋再冰凍。

1個(gè)模具里可以放多個(gè)組織嗎？

不建議，最好將每個(gè)組織塊單獨(dú)包埋，防止多個(gè)組織在1個(gè)OCT包埋塊中無(wú)法同時(shí)切到預(yù)期的目標(biāo)區(qū)域。

為什么有些植物組織需要抽真空包埋？

部分植物組織因其自身原因（有種皮包被等情況）在包埋過(guò)程中無(wú)法完全被OCT包裹，導(dǎo)致切片時(shí)發(fā)生碎裂、堆疊，或者樣本從OCT中脫落等現(xiàn)象，而抽真空可以幫助OCT更好地包埋植物組織，減少后期實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

二

當(dāng)樣本準(zhǔn)備好，就可以送到歐易生物開(kāi)始質(zhì)檢啦。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)就像“六月天，孩兒面”，有順利的晴天，也有不盡如人意的陰天，甚至糟糕的雷雨天。造成結(jié)果不理想的原因其實(shí)并不多，請(qǐng)聽(tīng)小歐為您一一解析：

同一樣本為什么重復(fù)抽提結(jié)果不一致？

空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目?jī)H收集組織樣本的少量切片進(jìn)行RNA抽提質(zhì)檢，并非整塊組織的總RNA，不同切片位置對(duì)應(yīng)的組織在RNA完整性上可能存在差異，尤其是切片的組織部位有壞死或大部分為結(jié)締組織，可能會(huì)影響抽提結(jié)果。

如何判斷切面已達(dá)到最大面？

被包埋冰凍后的樣本是無(wú)法肉眼判斷最大切面的，如果需要準(zhǔn)確判斷組織的最大切面，可以在包埋時(shí)（組織剛放入OCT中還未冰凍前）拍照并做好記錄以供參考。

為什么冰凍切片染色很難達(dá)到常規(guī)石蠟切片的染色效果？

冰凍切片與石蠟切片的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，使用的染色液和染色方法也不同，冰凍切片需要盡可能保證RNA的完整，所以在染色過(guò)程中不會(huì)使用分色液、二甲苯、乙醇等，而石蠟樣本則無(wú)需考慮這一點(diǎn)。

空間轉(zhuǎn)錄組為什么不封片？

空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目后續(xù)的正式實(shí)驗(yàn)（反轉(zhuǎn)錄和cDNA合成）都需要在正式玻片上進(jìn)行，封片后無(wú)法繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，為保持前期切片質(zhì)檢和正式實(shí)驗(yàn)相同的實(shí)驗(yàn)流程和條件，一般都不做封片處理。

如果老師需要其他染色結(jié)果，怎么辦？

老師可以聯(lián)系我們實(shí)驗(yàn)室小伙伴，我們可以將切好的白片提供給老師，以便進(jìn)行其他方法的染色。

植物樣本為什么存在脫片現(xiàn)象？

植物樣本切片中含較多纖維或淀粉的部位黏著性較低，極易發(fā)生脫片，極少數(shù)的動(dòng)物組織樣本例如骨樣本，鈣質(zhì)較高，也容易發(fā)生脫片。

切片脫片可以提前預(yù)警嗎？

可以。當(dāng)質(zhì)檢或透化過(guò)程中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)脫片現(xiàn)象時(shí)，即預(yù)示著正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有極大可能出現(xiàn)脫片現(xiàn)象。

三

質(zhì)檢完成之后，距離正式實(shí)驗(yàn)只差1個(gè)透化優(yōu)化預(yù)實(shí)驗(yàn)啦！預(yù)實(shí)驗(yàn)也是各位老師問(wèn)的最多的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，那么到底是哪些問(wèn)題讓各位老師產(chǎn)生了困惑呢?

為什么要做透化優(yōu)化？

確認(rèn)組織透化釋放出RNA的最佳時(shí)間，便于正式實(shí)驗(yàn)透化時(shí)可直接選用最佳的透化時(shí)間。

4個(gè)樣本都要做透化嗎？

建議最好每個(gè)樣本均進(jìn)行透化，因?yàn)榫退闶墙M織類(lèi)型完全相同的2個(gè)樣本，也可能存在最佳透化條件不同的情況。

透化為什么要重新切片？

透化優(yōu)化需要使用空轉(zhuǎn)特定的TO芯片，因此，在完成質(zhì)檢后，需要老師選擇好做透化實(shí)驗(yàn)的樣本重新切片，然后才能在TO芯片上貼片進(jìn)行透化預(yù)實(shí)驗(yàn)。

通透的時(shí)間梯度是多久呢？

3-30min，分為3min、6min、12min、18min、24min、30min共6個(gè)梯度，這個(gè)梯度一般情況下是固定的，特殊情況下，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行微調(diào)。

?

透化優(yōu)化選的切片位置必須是6.5mm*6.5mm的目標(biāo)區(qū)域嗎？

最好是目標(biāo)區(qū)域或靠近目標(biāo)區(qū)域，因?yàn)橥唤M織中若存在不同結(jié)構(gòu)，透化時(shí)間也不相同，6.5mm*6.5mm區(qū)域大小是為了和后面正式實(shí)驗(yàn)的大小相匹配，避免重復(fù)修塊對(duì)組織產(chǎn)生不利影響（用刀片重復(fù)修塊，可能影響組織形態(tài)及RNA質(zhì)量）。

為什么熒光圖上有的組織部位熒光強(qiáng)，有的部位熒光弱？

熒光圖需要結(jié)合HE染色結(jié)果來(lái)看，熒光強(qiáng)度受細(xì)胞核密集程度影響，細(xì)胞核越密集，通透釋放出的RNA越多，熒光越強(qiáng)，反之，細(xì)胞核越少，通透釋放出的RNA越少，熒光越弱。

透化結(jié)果是如何判定的？

根據(jù)陰性對(duì)照判斷組織是否有自發(fā)熒光，根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照判斷批次試劑的正常。而最佳透化時(shí)間，則根據(jù)熒光強(qiáng)度和組織整體熒光表現(xiàn)以及熒光是否存在模糊彌散來(lái)判定。

四

當(dāng)透化優(yōu)化預(yù)實(shí)驗(yàn)完成，距離終點(diǎn)就只差正式實(shí)驗(yàn)的一小步啦！勝利的曙光就在眼前，但這個(gè)時(shí)候也不能放松警惕，不少參與了正式實(shí)驗(yàn)的老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也會(huì)提出這些問(wèn)題：

正式實(shí)驗(yàn)為什么還要重新切片？

正式實(shí)驗(yàn)需要使用10x Genomics的基因表達(dá)玻片，在選擇好樣本及6.5mm*6.5mm的目標(biāo)區(qū)域之后，需要重新切片再貼片到正式玻片上開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

組織切片的大小一定要控制在6.5mm*6.5mm嗎？

空間轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)玻片捕獲區(qū)為6.5mm*6.5mm，超出大小的組織切片將不會(huì)被捕獲到，捕獲區(qū)邊框不屬于捕獲區(qū)，需要保留3/4捕獲區(qū)邊框，用于后期數(shù)據(jù)分析確認(rèn)圖像方向。

貼到玻片上的樣本可以取下重新貼嗎？

不可以，樣本切片靠霧化粘附到玻片上，無(wú)法完整取下切片，而且基因表達(dá)玻片上有引物，重新貼片一定會(huì)導(dǎo)致引物的脫落，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

正式實(shí)驗(yàn)的組織切片形狀為什么和質(zhì)檢的切片不一樣？

正式實(shí)驗(yàn)要重新貼片，中間會(huì)經(jīng)歷10張以內(nèi)的修片，修片可能會(huì)使組織切面發(fā)生改變。

?1個(gè)捕獲區(qū)可以貼多個(gè)組織嗎？

默認(rèn)1個(gè)捕獲區(qū)貼片1張，若組織切片較小，可以嘗試在不重疊的情況下貼多張（一般不超過(guò)5張）到同一個(gè)捕獲區(qū)域。

質(zhì)檢的時(shí)候沒(méi)有冰晶，為什么正式實(shí)驗(yàn)的時(shí)候可能會(huì)有冰晶？

雖然樣本質(zhì)檢的時(shí)候沒(méi)有冰晶，但后期實(shí)驗(yàn)切片需從-80℃拿出至-20℃的切片機(jī)，會(huì)有反復(fù)凍融的情況存在，導(dǎo)致樣本產(chǎn)生少量冰晶。當(dāng)然，此情況較為少見(jiàn)，目前只在1類(lèi)樣本中發(fā)現(xiàn)凍融產(chǎn)生的冰晶。

?4個(gè)樣本的最佳透化時(shí)間不同，可以在一張芯片上實(shí)驗(yàn)嗎？

可以，只要不是時(shí)間相差太久就沒(méi)問(wèn)題。

好啦，以上就是小歐的答疑啦，不知道有沒(méi)有幫助到各位老師呢？如有沒(méi)說(shuō)清楚的地方，小歐期待各位老師的留言~?~?~

PS：比饅頭還干的干貨，各位確定不評(píng)論轉(zhuǎn)發(fā)嗎？（讓我看看是誰(shuí)在偷偷學(xué)習(xí)，準(zhǔn)備內(nèi)卷）

歡迎百度搜索歐易生物——訪問(wèn)歐易生物官網(wǎng)——了解空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

猜你想看

1.?項(xiàng)目文章 | 歐易生物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組助力揭示心肌梗死后心臟免疫的動(dòng)態(tài)變化

2.?愛(ài)美之心人皆有之——基因表達(dá)可視化技能get

3.?招募令 | 新品搶先體驗(yàn)，exo+snRNA-seq一套樣品同時(shí)獲得兩套標(biāo)志物信息

4.?開(kāi)年紅~歐易生物2022年1月份68 篇項(xiàng)目文章匯總

End本文系歐易生物原創(chuàng)