肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，5年生存率約為6%。其中約80%為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織學(xué)類型，手術(shù)切除或根治性放化療提供了最佳的治愈前景。但許多肺癌患者對目前的治療手段還是存在抵抗心理的，包括化療和放療。然而，絕大多數(shù)病例是在晚期診斷出來的，患者的治療選擇是有限的。盡管在研究肺癌，靶向治療和臨床管理方面取得了一定的進(jìn)展，但許多知識在一些層面上仍有待補(bǔ)充。由于肺癌的遺傳多樣性和表型多樣性，使個體化治療正在成為現(xiàn)實(shí)。因此，這種癌癥有可能進(jìn)一步觸發(fā)未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）細(xì)胞系模型H1299，廣泛用于各種基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究，涉及肺癌增殖，相應(yīng)的抑制劑研究，腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移。研究人員使用H1299細(xì)胞系作為疾病模型來了解疾病的基本生物學(xué)，了解突變?nèi)绾斡绊懰幬锓磻?yīng)或耐藥性，了解藥物反應(yīng)性、靶標(biāo)識別、以及驗(yàn)證差異的機(jī)制，甚至對患者進(jìn)行分層，以便進(jìn)行更高效及有效的臨床試驗(yàn)。基因編輯技術(shù)正在迅速發(fā)展，成為一種現(xiàn)實(shí)的治療選擇。有策略地編輯患者基因組的能力可以構(gòu)成一場治療革命。基因組編輯技術(shù)在肺癌治療中具有巨大潛力，包括靶向癌基因和腫瘤抑制基因，化療耐藥性相關(guān)基因，靶向藥物和抑制劑治療相關(guān)基因，以促進(jìn)針對肺癌的進(jìn)一步臨床前研究和臨床治療。

應(yīng)用：

H1299細(xì)胞系（NCI-H1299或CRL-5803）是從一位43歲的白人男性、非小細(xì)胞肺癌患者的肺細(xì)胞中建立的，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。H1299作為一種永生化細(xì)胞系，可以無限地分裂，該細(xì)胞系的獨(dú)特特征是缺乏P53蛋白的表達(dá)，這也是它有增殖傾向的原因。據(jù)報道，該H1299細(xì)胞系分泌肽激素神經(jīng)介素B（Neuromedin B, NMB），但不分泌胃泌素釋放肽（Gastrin-releasing peptide, GRP），可用于研究人類肺癌。此前有研究表明，H1299細(xì)胞系可用于研究與肺癌化療藥物如紫杉醇的致敏性和耐藥性相關(guān)的基因，為提高化療對肺癌的治療效果提供了理論依據(jù)。

以下是H1299細(xì)胞系的一些應(yīng)用：

1. 靶向治療：抗血管生成藥物，靶向細(xì)胞信號傳導(dǎo)的藥物，生物學(xué)機(jī)制，毒性特征，其他生物制劑（凡德他尼，索拉非尼等）；

2. 藥物開發(fā)：PI3K抑制劑，MEK抑制劑，EGFR抑制劑等；

3. 分子遺傳學(xué)：利用基因組畸變，體細(xì)胞遺傳改變，特定酪氨酸激酶的致癌激活；

4. 表觀遺傳學(xué)：表觀遺傳調(diào)節(jié)因子突變，表觀遺傳治療等。

利用CRISPR-U基因編輯H1299細(xì)胞系

基因組編輯和細(xì)胞模型的建立可以推進(jìn)功能基因組學(xué)、信號通路、細(xì)胞代謝、細(xì)胞死亡、藥物研發(fā)、藥物反應(yīng)和癌癥研究等領(lǐng)域的研究計劃。CRISPR系統(tǒng)是一種精準(zhǔn)的基因組編輯技術(shù)，它可以通過將目的基因序列替換為所需供體序列來進(jìn)行基因敲除或敲入的基因組編輯操作。H1299是一種人肺腺癌細(xì)胞系模型，主要用于肺癌研究相關(guān)的藥物發(fā)現(xiàn)，疾病機(jī)制、起始、進(jìn)展和治療。CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯H1299細(xì)胞系可以幫助研究人員研究癌癥標(biāo)志，藥物抗性機(jī)制的公開，癌癥治療，細(xì)胞死亡研究，功能基因組學(xué)，信號傳導(dǎo)途徑，藥物發(fā)現(xiàn)，藥物應(yīng)答和細(xì)胞療法。

CRISPR/Cas9技術(shù)積極推動了肺癌相關(guān)的體內(nèi)和體外基因編輯的進(jìn)展，對分子醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了巨大影響。例如，結(jié)合紫杉醇的使用，敲除RSF1基因會導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1階段，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞遷移和增殖減少。此外，敲除H1299細(xì)胞中的巢蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制增殖和集落形成，并通過抑制上皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）來抑制細(xì)胞侵襲。源井生物開發(fā)的CRISPR-U?可用于基因編輯H1299細(xì)胞系。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞上進(jìn)行基因組編輯。源井生物可以定制真核細(xì)胞中的基因編輯，也可以在動物模型中產(chǎn)生各種基因修飾。

案例分析：

BCAR1基因敲除細(xì)胞系揭露BCAR1通過上調(diào)POLR2A促進(jìn)肺腺癌的增殖和細(xì)胞生長

乳腺癌抗雌激素抗性蛋白1（Breast cancer antiestrogen resistance protein 1, BCAR1；Crk相關(guān)底物, Crk‐associated substrate, CAS；p130cas）直接與各種磷酸酶和激酶的多個蛋白基序相互作用，并通過FAK橋間接締合調(diào)節(jié)Src。據(jù)報道，BCAR1可增強(qiáng)幾種癌癥（前列腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌，口腔鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌和肺癌）的腫瘤增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。它還能預(yù)測到肺腺癌病例的不良預(yù)后的情況。

在這項(xiàng)研究中，研究人員探討了BCAR1在肺腺癌增殖和細(xì)胞生長中的作用以及與BCAR1相互作用以觸發(fā)肺癌細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)在肺腺癌細(xì)胞系（NCl-H1975和NCl-H1299）上構(gòu)建BCAR1基因敲除細(xì)胞系，并進(jìn)行基因敲除細(xì)胞的增殖、集落形成、凋亡和細(xì)胞周期分析（圖1）。他們發(fā)現(xiàn)敲除組的BCAR1的表達(dá)明顯低于對照，及增殖被顯著抑制（圖1b，c）。H1975細(xì)胞的集落形成效率顯著降低，但在H1299細(xì)胞中BCAR-KO和NC之間無顯著差異（圖1d）。細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期進(jìn)程分析表明，BCAR被敲除后H1975和H1299細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期沒有差異（圖1 e，f）。

研究人員在293T細(xì)胞系中過表達(dá)BCAR1，并進(jìn)行免疫沉淀-質(zhì)譜（IP-MS）以及不同的下游分析。IP-MS和生物信息學(xué)的分析預(yù)測了與BCAR1的潛在相互作用（圖2）。生物信息學(xué)分析揭示了潛在的BCAR1相互作用蛋白的催化活性和轉(zhuǎn)移酶活性（圖2a，b）。癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫的驗(yàn)證證實(shí)了過表達(dá)BCAR1與癌癥相關(guān)（圖2c）。他們分析了與癌癥相關(guān)的相互作用伴侶的PPI分析，發(fā)現(xiàn)POLR2A，MAPK3，MOV10和XAB2的高表達(dá)預(yù)示了肺腺癌的不良預(yù)后（圖2d）。由于他們發(fā)現(xiàn)了POLR2A與更多的基因有著聯(lián)系以及參與信號級聯(lián)反應(yīng)的可能性，研究人員認(rèn)為需要進(jìn)一步驗(yàn)證POLR2A。

與鄰近的正常組織相比，肺腺癌組織中的POLR2A和BCAR1顯著增加（圖3a）。IHC染色的TMA如圖3b所示，表明BCAR1在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或兩個位置都有表達(dá)（圖3c）。然而，POLR2A只在細(xì)胞核中高表達(dá)。POLR2A表達(dá)與BCAR1表達(dá)有著顯著正相關(guān)關(guān)系（R=0.476，P<0.001），但BCAR1和POLR2A表達(dá)均與腫瘤大小無關(guān)。BCAR1或POLR2A的高表達(dá)預(yù)測了54例肺癌早期預(yù)后不良（圖3d）。研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證了H1975中的POLR2A，并且H1299細(xì)胞的敲除克隆和蛋白質(zhì)印跡分析證明了與NC細(xì)胞相比，BCAR1-KO中的POLR2A顯著降低（圖3e）。盡管CO-IP的結(jié)果為陰性，BCAR1調(diào)節(jié)H1975和H1299細(xì)胞中的POLR2A。（圖3f）。

總結(jié)以上發(fā)現(xiàn)，研究人員沒有發(fā)現(xiàn)H1975和H1299細(xì)胞中BCAR1和POLR2A之間的直接相互作用。我們?nèi)圆磺宄﨎CAR1和POLR2A是如何連接起來的的基本機(jī)制。此外，我們還需要協(xié)同分析來證明BCAR1和與其相關(guān)的蛋白之間相互作用在肺癌增殖和細(xì)胞生長中的作用，需要進(jìn)一步的強(qiáng)有力的研究來解決上述有待思考的問題。

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