肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見的實(shí)體腫瘤，復(fù)發(fā)率高，死亡率高。最近，發(fā)現(xiàn)一種新的VEGFA調(diào)控因子將有助于更好地了解HCC的進(jìn)展和抗血管生成治療的耐藥性。泛素特異性蛋白酶22（USP22）作為一種去泛素化酶，參與多種腫瘤的生物學(xué)過(guò)程。而USP22影響血管生成的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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在這里，我們的結(jié)果表明USP22作為VEGFA轉(zhuǎn)錄的共激活劑。重要的是，USP22通過(guò)其去泛素酶活性參與維持ZEB1的穩(wěn)定性。USP22被招募到VEGFA啟動(dòng)子上的ZEB1結(jié)合元件上，從而改變組蛋白H2Bub水平，增強(qiáng)ZEB1介導(dǎo)的VEGFA轉(zhuǎn)錄。USP22缺失降低細(xì)胞增殖、遷移、血管擬態(tài)（VM）形成和血管生成。

結(jié)果還表明，敲除USP22可以抑制荷瘤裸鼠肝癌的生長(zhǎng)。此外，在臨床HCC樣本中USP22的表達(dá)與ZEB1的表達(dá)呈正相關(guān)。因此，USP22通過(guò)上調(diào)VEGFA的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)了HCC進(jìn)展，這為HCC抗血管生成藥物耐藥提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

VEGFA-165（Abmole，M9413，純度>95%）是一種強(qiáng)有力的生長(zhǎng)和血管生成細(xì)胞因子。

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為了進(jìn)一步研究USP22對(duì)HCC進(jìn)展的影響，我們首先通過(guò)慢病毒感染穩(wěn)定敲除USP22 （shUSP22）的Huh7細(xì)胞和PLC/PRF/5細(xì)胞，并以打亂shRNA作為對(duì)照（shCtrl）。western blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了USP22的敲除效率。采用MTS實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)研究USP22對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，USP22缺失顯著抑制了細(xì)胞增殖（圖5A）。被抑制的細(xì)胞增殖通過(guò)重組人蛋白VEGFA-165處理部分恢復(fù)，這是一種主要的亞型，具有與天然VEGFA密切對(duì)應(yīng)的特性（圖5B, C）。數(shù)據(jù)表明，USP22在HCC細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖，USP22對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響部分與VEGFA有關(guān)。

我們觀察到USP22的下調(diào)導(dǎo)致HCC細(xì)胞形態(tài)萎縮，細(xì)胞間黏附增強(qiáng)，細(xì)胞集落之間難以形成聯(lián)系（圖5D）。這些結(jié)果提示USP22可能參與了HCC細(xì)胞的基質(zhì)重塑或運(yùn)動(dòng)。血管生成擬態(tài)（VM）描述了侵襲性癌細(xì)胞通過(guò)變形和基質(zhì)重塑形成新生血管網(wǎng)絡(luò)的可塑性。因此，采用試管形成實(shí)驗(yàn)研究USP22對(duì)HCCLM3細(xì)胞誘導(dǎo)的VM形成的影響。結(jié)果顯示，USP22缺失顯著抑制了管狀網(wǎng)絡(luò)的形成（圖5E）。這些結(jié)果表明，USP22的表達(dá)可能促進(jìn)了HCC來(lái)源細(xì)胞系中VM的形成。

接下來(lái)，為了確定USP22對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲行為的影響，我們?cè)趕hUSP22 Huh7或shUSP22 PLC/PRF/5細(xì)胞中進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)。我們的數(shù)據(jù)表明，USP22的缺失抑制了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲（圖5F, G）。為了進(jìn)一步研究USP22對(duì)血管生成的潛在影響，我們首先采用ELISA法檢測(cè)Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGFA的水平。結(jié)果表明，USP22缺失抑制了VEGFA的分泌（圖5H）。從shUSP22或shCtrl Huh7細(xì)胞中收集條件培養(yǎng)基，體外進(jìn)行HUVEC管形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在shUSP22 Huh7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，HUVEC細(xì)胞之間的細(xì)胞間連接減少（圖5I）。在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVEC集落形成實(shí)驗(yàn)表明，在shUSP22 Huh7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，HUVEC的增殖也減少（圖5J）。這些數(shù)據(jù)表明，USP22促進(jìn)HCC血管生成部分與VEGFA的表達(dá)有關(guān)。綜上所述，結(jié)果表明USP22參與了HCC的增殖、侵襲、VM形成和血管生成。

為了研究USP22在小鼠肝癌生長(zhǎng)中的作用，在小鼠異種移植模型中進(jìn)行了腫瘤生長(zhǎng)分析。如圖6A-D所示，來(lái)自shUSP22 HCCLM3細(xì)胞的腫瘤比來(lái)自shCtrl細(xì)胞的腫瘤體積更小，生長(zhǎng)速度更慢。shUSP22腫瘤形成的血管比對(duì)照組細(xì)。注射VEGFA-165可部分恢復(fù)USP22下調(diào)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。然后檢測(cè)了USP22、VEGFA和ZEB1在這些異種移植瘤中的表達(dá)。

結(jié)果表明，USP22的下調(diào)降低了VEGFA mRNA或蛋白的表達(dá)。而USP22的缺失會(huì)降低ZEB1蛋白，而不是降低mRNA水平（圖6E, F）。此外，USP22在異種移植瘤中的表達(dá)也與VEGFA的表達(dá)呈正相關(guān)。為了測(cè)試ZEB1在我們的模型中的作用，用慢病毒構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)USP22的HCC細(xì)胞。將對(duì)照組和USP22過(guò)表達(dá)組的HCCLM3細(xì)胞皮下注射入BALB/c裸鼠進(jìn)行異種移植實(shí)驗(yàn)。

2周后，當(dāng)腫瘤大小約為100 mm3時(shí)，將攜帶usp22過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞隨機(jī)分為兩組：在腫瘤中注射ZEB1 siRNA（7.5 μg），另一組每72 h注射等量的陰性對(duì)照，持續(xù)2周。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)USP22可顯著促進(jìn)HCC的生長(zhǎng)，而敲低ZEB1則抑制了USP22對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用（圖6G-J），說(shuō)明ZEB1參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，USP22促進(jìn)HCC生長(zhǎng)與ZEB1有一定的關(guān)系。

免疫組化結(jié)果顯示，USP22缺失降低了異種移植瘤中USP22、ZEB1或VEGFA的表達(dá)。周期性酸-希夫（PAS）染色常用來(lái)指示糖原或多糖（紫紅色）的存在，以獲取腫瘤血管浸潤(rùn)的可能性。采用CD31和PAS雙染色方法區(qū)分VM富含基質(zhì)的形態(tài)模式。VM結(jié)構(gòu)為腫瘤細(xì)胞排列的血管樣通道，PAS陽(yáng)性/CD31陰性染色（PAS + CD31-），PAS +和CD31 +染色部分為內(nèi)皮血管。數(shù)據(jù)顯示，與shCtrl腫瘤相比，shUSP22中VM（PAS + CD31-染色）的數(shù)量較少，這表明抑制USP22可能會(huì)抑制VM的形成（圖7A）。

綜上所述，結(jié)果表明USP22促進(jìn)小鼠HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和VM形成。在揭示了USP22維持了ZEB1的穩(wěn)定性后，接下來(lái)用免疫組化的方法檢測(cè)了24對(duì)人HCC病理切片中USP22和ZEB1的表達(dá)。結(jié)果顯示USP22在HCC中的表達(dá)與ZEB1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖7B）。這些結(jié)果表明USP22/ZEB1/VEGFA促進(jìn)了HCC的進(jìn)展。

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鳴謝：Kai Zeng, et al. Cell Death Dis. 2023 Mar 11;14(3):194.