染色體外環(huán)狀DNA：腫瘤研究新方向
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ecDNA出現在14%的原發(fā)性癌癥和超過40%的轉移性癌癥中，而在正常組織中很少見到。ecDNA可以驅動部分基因發(fā)生擴增形成高拷貝數，在遺傳過程中不遵循孟德爾定律，可以實現在子代細胞的快速積累和隨機分配，驅動腫瘤快速進化，在藥物治療的環(huán)境中逐步增強原癌基因表達的依賴性。腫瘤細胞中一旦發(fā)生這種基因擴增，免疫治療或者靶向治療往往是無效的。
可以把ecDNA比做一個工廠，這個工廠的成立形式多樣且功能獨立，有趣的是由該工廠加工得到的產品（ecDNA）可重新整合至原染色體當中，從而增強腫瘤基因異質性；同時，一座座工廠協(xié)同合作，當地處鄰近區(qū)域時（空間位置），以其中某個工廠作為“hub”有序的推進癌細胞中原癌基因的表達，幫助癌細胞進化，耐藥，所以如何摧毀這些工廠是生物學家接下來需要思考的重要問題。
“ecDNA相關研究的快速發(fā)展能夠幫助解釋為什么發(fā)生原癌基因擴增的癌細胞惡性程度更高，為什么傳統(tǒng)的治療方法對于許多晚期病人無效。”ecDNA研究引領者，Paul S. Mischel說到，“ecDNA的相關研究為創(chuàng)新性、個性化治療帶來了新的希望，有望在未來幫助更多惡性腫瘤患者”。
實際上圍繞ecDNA與耐藥相關的討論從未停止，Peter J. Campbell 和Don W. Cleveland合作，于2020年發(fā)表在Nature上的文章就報道了ecDNA是如何驅動基因擴增從而讓癌細胞發(fā)生耐藥現象的相關研究。文章第一作者Ofer Shoshani博士談到“耐藥是癌癥治療中遇到的最大麻煩之一，如果能有效解決這一問題，許多患者的生存期一定會得到延長”，在2017年Paul S. Mischel發(fā)表在Nature上的文章也報道ecDNA驅動腫瘤進化和異質性問題。
1,ecDNA在多種癌癥中廣泛存在
2017年發(fā)表的Nature文章嘗試通過WGS數據分析獲得ecDNA的相關信息，通過全基因組測序對17個不同的癌癥類型的2572個處于有絲分裂中期的細胞進行測序整合分析，已經發(fā)現ecDNA存在于半數以上人類癌癥中，不同癌癥中成環(huán)的頻率不同，但在正常細胞中幾乎不見蹤影。數據模型預測認為相比于棒狀染色體結構的基因元件，ecDNA擴增原癌基因的效率更高，從而獲得結論，ecDNA是加速癌癥進化的重要原因之一。
（https://doi.org/10.1038/nature21356）
整個實驗對143份樣品（處于染色體中期的共2572個細胞）進行WGS檢測，其中對比117例與8例正常對照，結合FISH結果進行驗證，發(fā)現ecDNA廣泛存在于人類癌癥樣本中，但正常樣本中并沒有發(fā)現ecDNA存在。
2,ecDNA是染色體碎裂與重組的產物
Peter和Don的文章中指出，染色體碎裂（chromothripsis）現象與隨機再組裝是ecDNA生物合成的主要途徑，Ofer認為這篇文章的主要貢獻正是指出染色體碎裂同ecDNA形成的相關性?；驍U增現象在甲氨蝶呤（methotrexate）耐藥細胞中被首次發(fā)現，起初的研究主要關注的是短的染色體外環(huán)狀DNA（ecDNA，被稱為double minutes, DMs），有研究也證明這種DMs可以重新整合到染色體當中。WGS數據分析能夠清晰的給出基因重組的證明，比如基因擴增和碎裂，而染色體碎裂是一種非常劇烈的染色體碎片化過程，之后這些碎片以幾乎隨機的方式重新鏈接起來。ecDNA的生物形成可能性有很多，BFB（breakage-fusion-bridge，斷裂融合橋）、染色體內的串聯(lián)復制（Intrachromosomal tandem duplications）或者肉瘤當中發(fā)現的新染色體（neochromosome）都有可能形成ecDNA。這篇文章重點強調的另一方面是，在細胞外界不斷施加選擇壓力時，包括ecDNA在內的染色體外生物結構是如何應答的。
（https://doi.org/10.1038/s41586-020-03064-z）
隨著甲氨蝶呤濃度的增加（40，60到80nM），選擇壓力不斷增加，具有抗性的Hela細胞中DMs所占比例也在不斷增加，可知ecDNA比例會隨著選擇壓力的增加而增加，而之后的結果證明伴隨選擇壓力的增加，染色體碎裂可以優(yōu)化ecDNA的結果，驅動ecDNA結構的進化與整合，這種逐步的、動態(tài)的響應最終導致包括DHFR在內的部分基因拷貝數增加。此項研究的意義是通過break-fusion-bridge將環(huán)狀DNA和染色體碎裂這兩個被發(fā)現了超過70年的生物現象相連接，這種染色體碎裂片段的優(yōu)化和整合被描述為依賴于NHEJ（Non-homologous end joining，非同源末端連接）和PARP（polyADP-ribose polymerases）的生物過程，文章指出，既然像甲氨蝶呤和維莫非尼（vemurafenib）在內的化療藥物能夠引起染色體碎裂之后的片段重組與ecDNA形式的原癌基因擴增，那么靶向藥物結合DNA修復抑制劑或許可以有效的阻止癌細胞的進化、侵襲甚至耐藥現象的發(fā)生，從而帶來腫瘤治療方法帶來新的思路。
3,多個ecDNA協(xié)同合作增強原癌基因表達
ecDNA形式的原癌基因擴增與耐藥有關，生物學的具體是如何體現的？2021年發(fā)表的Nature文章建立了ecDNA擴增與原癌基因表達之間的關系，文章報道的10-100個ecDNA以cluster的形式實現增強子-基因相互作用的方式來驅動原癌基因的表達。
在之前的研究中已經發(fā)現了ecDNA可以增強原癌基因的表達，但似乎之前的理解中，研究者遠遠的低估了ecDNA對原癌基因表達驅動的能力和方式的多樣性。當ecDNA在空間上同其他ecDNA聚集捆綁的時候，這種捆綁以某個ecDNA為核心（hub），其他ecDNA輔助，使轉錄原癌基因的可能性大大增加，例如，在結直腸癌細胞系中，BRD4捆綁的ecDNA促進MYC的表達，而JQ1可以驅散（disperse）這群ecDNA從而達到抑制ecDNA原癌基因轉錄的活性，BRD4結合的PVT1啟動子與MYC融合以ecDNA的形式擴增，在其他ecDNA攜帶的enhancer的輔助幫助下強有力的促進了MYC的表達，CRISPR技術對ecDNA enhancer的干擾可以有效的阻止這種ecDNA特有的enhancer-gene的轉錄活化模式，這種合作性質的腫瘤進化機制（cooperative evolution）或許可以為癌癥治療提供新的思路和方向。
（doi: 10.1038/s41586-021-04116-8）
上圖的f結果可以看出ecDNA的聚集情況（clustering score）同MYC的轉錄概率成正相關，當攜帶有各種調控元件的ecDNA捆綁在一起時，MYC的轉錄概率增大，具體的結構在文章的后半部分做了詳細描述。
（doi: 10.1038/s41586-021-04116-8）
上圖的g和i展示的內容是一個非常龐大的ecDNA團體，多個ecDNA聚集在一起成為一個cluster，這些ecDNA貢獻了增強子，原癌基因，圖中的灰色部分BRD4蛋白作為中間介質，將多個ecDNA捆綁（tether）在一起，在這個聚集體中增強子對原癌基因的啟動活性增強從而對原癌基因表達進行擴增，如果存在JQ1抑制因素，可以驅散這個ecDNA聚集體，讓增強子和原癌基因在空間上形成隔離，從而無法對原癌基因進行轉錄激活加強。i圖是一個典型的ecDNA合作擴增模式圖，而g圖中給出的是不同ecDNA之間的相互作用，即攜帶有不同原癌基因ecDNA相互作用協(xié)同發(fā)揮功能的模式圖。由此可以看出，ecDNA的原癌基因表達增強活性實際上非常依賴于各種協(xié)同因子保持空間上的緊密關系，如果實驗干預破壞多分子的緊密關系，擴增的效果會被大大地削弱，對這一點的深入理解對于臨床應用具有重要的意義。
（https://doi.org/10.1038/s41586-019-1763-5）
4,ecDNA的探索方法與模式
深入理解ecDNA促進原癌基因表達的作用，必須更清楚地了解ecDNA本身特征。ecDNA的拓撲異構特征如何？同棒狀染色體有何不同？首先ecDNA是環(huán)狀結構，使用AA算法（Amplicon Architecutre）對WGS數據分析可以找到線性或者環(huán)狀擴增子，而環(huán)狀結構的存在可以被多個discordant reads支持，sanger測序也能對這種反式剪切的結構進行驗證。對于ecDNA結構的重塑和空間結構的理解，本文提到的幾篇文章均使用了多種組學聯(lián)合的方式，對整個染色體外結構進行探索。- 最直接的方法是使用顯微技術、原位染色、掃描電鏡等技術對處于有絲分裂中期的癌細胞進行直接染色觀察；
- ecDNA的轉錄活性離不開轉錄因子的幫助，因此ChIP-seq檢測發(fā)現H3K4me1和H3K27ac修飾marker存在于ecDNA；
- 雖然ecDNA具有一定的高級結構，但是這種結構還無法像棒狀染色體一樣緊密，ATAC-seq測序數據分析可以發(fā)現ecDNA具有一定開放性的染色體結構，對應的，ATAC-seq信號的數量相對更多；
- 4C/3C-seq，重現染色體遠距離通訊的重要手段。
- circDNA-seq，消化線性DNA，純化感興趣的環(huán)狀DNA分子進行擴增測序；
（https://doi.org/10.1038/s41586-019-1763-5）
多組學聯(lián)合分析重現ecDNA的典型案例如上圖所示，其中circOS圖展現了包括RNA-seq、ATAC-seq、WGS、PLAC-seq（4C-seq+ChIP-seq）等多個組學的信息，使用WGS分析拷貝數變化，尋找擴增子，使用ATAC-seq分析成環(huán)區(qū)域的染色質開放性，使用RNA-seq同時分析該區(qū)域的轉錄結果，通過PLAC-seq或4C-seq分析成環(huán)區(qū)域的基因遠距離相互聯(lián)系，ChIP-seq分析在部分位置是否存在表觀遺傳修飾。通過多組學分析將ecDNA的環(huán)境同下游表達同時進行展示。
ecDNA的研究在最近的三年內受到廣泛的關注，目前相關研究仍然處于早期階段，有關ecDNA的生物合成，調控機制，下游功能還有很多的問題需要回答，但是可以預見的是未來幾年內，尤其在腫瘤研究當中，ecDNA同耐藥與治療的關系會一直是焦點。在之后的研究當中，我們會更加詳細地介紹有關ecDNA的高通量測序方法和分析策略，讓廣大科研人員了解ecDNA的研究前沿。
