標題：Proteogenomics refines the molecular classification of chronic lymphocytic leukemia

期刊：Nature Communications（IF =17.694）

時間：2022.10

背景

慢性淋巴細胞白血?。–LL）是一種常見成人白血病。特征是外周血，骨髓和淋巴結中成熟B淋巴細胞的積累。該惡性腫瘤具有非常異質(zhì)的臨床病程。部分患者可以遵循“觀察與等待”策略多年，而另一些患者則需要頻繁治療且總生存期較短。質(zhì)譜的發(fā)展促進了腫瘤標本的平行深層蛋白質(zhì)組學分析。癌癥在蛋白質(zhì)組水平上的異質(zhì)性可用于解釋基因組和轉(zhuǎn)錄組學診斷方法之外的治療反應和預后差異。蛋白質(zhì)組學與基因組學等其他數(shù)據(jù)的整合已經(jīng)開始增強對癌癥實體的理解。然而，在臨床相關靶點和功能表型方面大多缺乏以蛋白質(zhì)組為中心的數(shù)據(jù)整合。蛋白質(zhì)組學與疾病分類的相關性在臨床異質(zhì)性癌癥實體，如慢性淋巴細胞白血?。–LL）中仍有待確定。

文章重點

在臨床特征良好且具有代表性的?CLL發(fā)現(xiàn)隊列中進行了蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組以及基因和離體藥物反應分析?；诘鞍踪|(zhì)組學，通過無監(jiān)督聚類區(qū)分了六個亞組。在六個已確定的亞組中，發(fā)現(xiàn)了一個只在蛋白質(zhì)組水平上檢測到的未知CLL患者亞群。特征表現(xiàn)為與異常剪接相關的剪接體蛋白豐度提高和B細胞受體信號蛋白豐度降低。該結果可將剪接體蛋白豐度與CLL中的異常剪接和不良結果聯(lián)系起來。多組學分析完善了CLL的分類，并強調(diào)了蛋白質(zhì)組學在改善癌癥患者分層方面的潛力。

技術路線

研究內(nèi)容

01基因型分子表型關系

為了探索基因型與表型的關系，作者對已知的CLL基因突變、mRNA表達和蛋白質(zhì)豐度之間的關系進行研究。首先分析了與CLL基因突變相關的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)12號染色體對差異蛋白質(zhì)豐度的影響最大。同時，12號染色體也與許多顯著的基因表達變化有關。而后進一步研究了與12號染色體相關的蛋白質(zhì)豐度變化是否與基因劑量效應有關。結果顯示雖然染色體增加了位于12號染色體上的蛋白質(zhì)豐度，但63%被確定為差異的蛋白質(zhì)是由位于其他染色體上的基因表達的。盡管像12號染色體或體細胞突變的存在轉(zhuǎn)化為mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化，但蛋白質(zhì)豐度與相應mRNA水平之間的總體相關性很低。表明癌癥蛋白質(zhì)組的翻譯后調(diào)節(jié)范圍很廣。

?相關性分析顯示與12號染色體或IGHV突變狀態(tài)相關的差異的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出更高的mRNA -蛋白質(zhì)相關性。而與SF3B1突變相關的差異蛋白質(zhì)并非如此，證明了12號染色體和IGHV突變在CLL中蛋白質(zhì)豐度變化與基因表達變化之間的直接聯(lián)系，而SF3B1突變的致癌作用是由轉(zhuǎn)錄后機制引起的。在對基因型與差異蛋白關系研究中作者發(fā)現(xiàn)，突變樣品中腫瘤抑制蛋白ATM和核轉(zhuǎn)運蛋白XPO1的蛋白水平低于野生型樣品。這種關聯(lián)僅在蛋白質(zhì)上觀察到，而不是在轉(zhuǎn)錄本水平上觀察到。表明CLL蛋白質(zhì)組不僅顯示出mRNA水平上也存在的許多變化，而且還揭示了轉(zhuǎn)錄組中不明顯的生物學關系。

02綜合分析揭示與結局相關的蛋白質(zhì)組學因素

進行了無偏、無監(jiān)督的多組學因子分析（MOFA），以獲得多個數(shù)據(jù)集的協(xié)變量的綜合視圖。MOFA揭示了11個潛在因素（LF），只有LF1、LF2和LF9與下一次治療的時間（TTNT）顯著相關。LF1和LF2在所有數(shù)據(jù)（蛋白質(zhì)組、RNA和基因組）中表現(xiàn)活躍，并且主要由基因組數(shù)據(jù)中的12染色體和IGHV突變驅(qū)動。在發(fā)現(xiàn)隊列中，LF1和LF2中的蛋白質(zhì)不僅與TTNT顯著相關，在蛋白質(zhì)組學驗證隊列中也與總體存活率顯著相關。除了LF1和LF2之外，LF9僅在蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)中有活性表現(xiàn)。MOFA分析表明了蛋白質(zhì)組學分析揭示了其他組學數(shù)據(jù)無法檢測到的臨床相關生物學內(nèi)容。

03基于蛋白質(zhì)組學的CLL分層確定了六個不同的亞組

由于發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學與臨床治療時間（TTNT）的獨有關聯(lián)，作者決定深入探索蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)。為了描述患者蛋白質(zhì)譜之間的相似性和差異性，對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集進行了一致性聚類。聚類確定了六個蛋白質(zhì)組（PGs），而后分析了是否有基因突變與不同的PGs相關。有4個PGs分別代表12染色體/MCLL（Tris12M-PG，n = 9）、12染色體/U-CLL（Tris12U-PG，n = 8）、M-CLL（M-PG，n = 18）和U-CLL（U-PG，n = 17）。其中1例Tris12M-PG患者被注釋為12染色體陰性，攜帶12亞克隆染色體。Tris12M-PG、Tris12U-PG和M-PG在未經(jīng)治療的患者中均有富集作用。第五個亞組TP53- PG，雖只包含4個患者樣本，但4個樣本中有3個存在TP53突變。另外發(fā)現(xiàn)了一個新的基于蛋白質(zhì)組學的分組，與所有其他組相比，該組與已知的基因突變類型沒有任何關聯(lián)，且只有12染色體不在此組之中。為了將這些基于蛋白質(zhì)組學的分組與轉(zhuǎn)錄組聯(lián)系起來，對相應的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了共識聚類?；谵D(zhuǎn)錄組的亞群僅與蛋白質(zhì)組部分重疊。轉(zhuǎn)錄組1-3與蛋白組Tris12U-PG、Tris12M-PG、M-PG和U-PG之間存在對應關系，但沒有基因注釋的新亞組（New-PG）和TP53-PG（TP53）被劃分為多個轉(zhuǎn)錄組亞組。

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作者進一步調(diào)查了所有PGs的藥物反應概況。盡管效應量不同，但各組對大多數(shù)CLL相關藥物有反應。只有TP53突變組TP53-PG對包括化療藥物在內(nèi)的許多藥物的總體反應較差。

基于蛋白質(zhì)組學的分組將不同TTNT的患者分開，顯示了各亞組的臨床相關性。雖然新的PG對突變的TP53和未突變的IGHV基因等高危因素沒有富集，但它具有最短的TTNT且所有PGs的體內(nèi)淋巴細胞倍增時間最快，表明這些腫瘤的增殖能力增加。相比之下，M-PG（M-CLL，無12染色體）的TTNT明顯長于所有其他亞組。綜上所述，相對蛋白豐度的無監(jiān)督聚類將CLL患者分為6個臨床相關組，其中5個可以用已知的基因特征來解釋，而一個結果不良的新亞組僅基于蛋白質(zhì)組學來識別。

04新不良結果組ASB-CLL的細胞過程失調(diào)

新的不良結果亞組約占發(fā)現(xiàn)隊列的20%，且只能在蛋白質(zhì)水平上被識別。為了描述該組中哪些途徑和過程發(fā)生了改變，分析了新PG和其他PGs之間的差異蛋白質(zhì)豐度。富集分析確定BcR信號蛋白如BTK、PLCG2和PIK3CD是新PG中下調(diào)最顯著的蛋白。盡管IGHV突變是CLL34中BcR活性的重要替代物，但新PG中這些中樞BcR信號成分的下調(diào)獨立于IGHV突變。在基質(zhì)細胞和CLL細胞共培養(yǎng)模型中進一步測量了樣本對伊布替尼的體外反應，發(fā)現(xiàn)新PG對BcR抑制劑伊布替尼的反應較低。此外，BcR信號蛋白的磷酸化水平在新PG中也表現(xiàn)出類似的下調(diào)。

新PG的進一步特征是參與支鏈氨基酸（BCAA）降解的酶的上調(diào)和蛋白酶體蛋白的下調(diào)，與剪接體相關的蛋白質(zhì)在新PG中表達最顯著。作者將該組命名為ASB-CLL。觀察到剪接體成分的蛋白質(zhì)和相應mRNA水平之間的相關性非常低，解釋了在轉(zhuǎn)錄組水平上不能檢測到ASB-CLL的原因。剪接因子突變（例如SF3B1突變）在CLL中反復發(fā)生，但SF3B1的突變在ASB-CLL中既不富集也不缺失。SF3B1突變型和野生型CLL患者之間的SF3B1蛋白水平?jīng)]有差異，但ASB-CLL患者的SF3B1蛋白水平明顯高于其他亞組。相關研究稱，SF3B1突變的主要致癌效應是通過在腫瘤抑制基因BRD9中包含毒物外顯子，然后下調(diào)BRD935來介導的。但ASB-CLL中未檢測到BRD9錯剪接或下調(diào)。對于12例ASB-CLL患者中的10例，作者進一步對腫瘤和匹配的正常對照進行了全外顯子測序，以探討是否可以在該亞組中發(fā)現(xiàn)剪接體蛋白中的任何其他體細胞突變。除了SF3B1突變患者中的DDX5突變外，未檢測到任何其他剪接因子突變。結果表明，在ASB-CLL中檢測到的剪接體蛋白豐度增加與剪接體突變無關。

為了進一步確定ASB-CLL中剪接體的上調(diào)是否有任何功能后果，作者分析了該組的mRNA和肽水平上的選擇性剪接。使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和rMATS注釋所有患者的所有可能的選擇性剪接情況。從1000個選擇性剪接事件中計算了每個患者的平均剪接百分比（PSI）值。ASB-CLL與所有其他亞組之間的比較顯示，ASB-CL的外顯子使用情況不同，跳過的外顯子更少，3′和5′剪接位點使用更多。此外，觀察到平均剪接體蛋白豐度與上述平均PSI值之間存在統(tǒng)計學顯著相關性。作者檢測到427個外顯子跳躍事件，與所有其他蛋白質(zhì)組亞組相比，ASB-CLL具有明顯不同的選擇性剪接模式。這些外顯子跳躍事件在ASB-CLL中的發(fā)生率明顯高于偶然發(fā)生的預期。未觀察到差異外顯子跳過事件對編碼區(qū)或非翻譯區(qū)的偏好。在肽水平上也檢測到ASB-CLL的顯著不同的外顯子使用。因此，ASB-CLL的特征是BcR通路成分的豐度較低，BcR成分的磷酸化水平較低，剪接體功能發(fā)生改變。

05ASB-CLL在獨立隊列中的驗證

為了在DIA蛋白質(zhì)組學中可靠地檢測ASB-CLL，在HiRIEF數(shù)據(jù)集中對所有BcR和剪接體蛋白訓練了k-top評分對（k-TSP）分類器。將分類器應用于Validation1_DIA隊列，識別出28例ASB-CLL患者（10例未治療，15例預治療，3例未知），對應于17%的患者。ASB-CLL的這一比例與訓練數(shù)據(jù)集相似。正如預期，ASB-CLL中BcR蛋白下調(diào)，剪接體蛋白上調(diào)。此外，ASB-CLL的特征是BCAA蛋白上調(diào)和蛋白酶體蛋白下調(diào)，這與發(fā)現(xiàn)隊列中觀察到的結果一致。ASB-CLL患者的總體生存率明顯較差，在從未接受治療的患者獲得的樣本亞組中得到證實。Eagle及其同事將k-TSP分類器應用于獨立隊列，該隊列包括9名U-CLL和9名M-CLL患者。此外，將k-TSP分類器應用于蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含與作者的研究重疊的患者（91例CLL患者中的30例），但該數(shù)據(jù)集是在使用DIA蛋白質(zhì)組學的不同實驗室中獨立生成的。91例CLC樣品中，共有9例（10%）被分類為ASB-CLL，可以確認以ASB-CLC蛋白質(zhì)組譜為特征的患者的不良結果。

06細胞來源對12染色體對蛋白質(zhì)組和臨床結果的影響

為了了解IGHV和12染色體對蛋白質(zhì)組的影響，對發(fā)現(xiàn)隊列中獨立于亞組的所有樣本進行了相關網(wǎng)絡分析，以確定CLL蛋白質(zhì)組中重要的生物模塊。結果顯示了6個生物模塊（N1-N6）在所有篩選的CLL患者樣本中都受到了影響。而后對這些模塊進行富集分析，并量化了每個PG中每個模塊。正如預期的那樣，兩個12染色體亞組Tris12M-PG和Tris12U-PG顯示出位于12號染色體上的蛋白質(zhì)和參與BcR信號傳導（N2）的蛋白質(zhì)水平升高。進一步評估了這種上調(diào)對離體藥物反應的功能，發(fā)現(xiàn)Tris12M-PG和Tris12U-PG對BcR通路抑制劑（例如伊布替尼）明顯更敏感。

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盡管相似，但Tris12M-PG和Tris12U-PG之間也在生物學上存在相關的差異，取決于IGHV的突變背景。參與趨化因子和細胞因子信號轉(zhuǎn)導蛋白的模塊（N6）在Tris12U-PG中明顯更豐富。通過調(diào)整沒有12染色體的病例中U-CLL/M-CLL的差異，發(fā)現(xiàn)在12染色體的背景下，U-CLL病例表現(xiàn)出MAPK信號蛋白水平增加，而M-CLL病例中細胞粘附分子水平增加。還可以識別M-CLL和U-CLL之間BcR信號通路的差異。對于U-CLL，12染色體表現(xiàn)出該通路的細胞內(nèi)成分進一步增加（如NFKB1、MAPK13），而M-CLL，12染色體表現(xiàn)出膜結合成分的增加（如CD21、CD79A/B）。同時在磷酸化水平上也很明顯，其中膜結合蛋白和膜近端蛋白在Tris12M-PG中表現(xiàn)出磷酸化的增加（如CD19，LYN），細胞內(nèi)成分（如MAP2K2、NFATC2、AKT2）的磷酸化水平升高。作者進一步試圖研究12染色體對M-CLL和U-CLL的自然病程的影響，不依賴于任何治療環(huán)境，以首次治療的時間（TTFT）為終點。12染色體沒有改變U-CLL患者的TTFT，但顯著降低了M-CLL患者的TTFT。在620例未經(jīng)治療的CLL患者隊列中得到證實。在463例統(tǒng)一使用伊布替尼治療的CLL患者隊列中，未觀察到Tris12M-PG患者的快速進展。對于接受伊布替尼作為一線治療和復發(fā)治療的患者也是如此。然而，12染色體患者在體內(nèi)和體外對伊布替尼有更好的反應。因此，作者假設12染色體患者對BcR抑制劑的更好的反應平衡了未治療的Tris12M-PG患者觀察到的快速進展情況。

總結：

作者應用了基于深度質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學，使用HiRIEF分餾和數(shù)據(jù)依賴性采集，徹底表征CLL的疾病生物學，然后采用DIA蛋白質(zhì)組學來驗證以前未知的癌癥亞組。對CLL的綜合多組學分析全面概述了基因變化，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的相互作用，以及藥物反應和臨床結果的功能內(nèi)容。