2022?HALF YEAR
文獻(xiàn)精選

2022上半年使用Monolith發(fā)表的國內(nèi)文獻(xiàn)接近100篇，小編按照疾病機制，結(jié)構(gòu)生物學(xué)和植物科學(xué)三個方向選取了10篇文章分享給大家。

以下文章包含細(xì)胞裂解液，無標(biāo)記，超大復(fù)合物，離子以及雙結(jié)合位點檢測等應(yīng)用，希望會對大家的實驗有所幫助。

疾 病 機 制

01

北京大學(xué)朱健課題組

必需氨基酸受體抵御非酒精性脂肪肝病的作用機制

常規(guī)認(rèn)知中，脂肪肝多見于營養(yǎng)過剩的肥胖人群。但事實上，消瘦人群也有可能因營養(yǎng)不良而患上脂肪肝病。2022年3月3日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心朱健課題組在Molecular Cell在線發(fā)表了題為"Amelioration of hepatic steatosis by dietary essential amino acid-induced ubiquitination"?的研究論文。研究人員發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞中一種重要的必需氨基酸受體Ubr1。當(dāng)必需氨基酸攝入不足時，Ubr1蛋白的生理功能受到抑制，導(dǎo)致肝臟脂肪的積累并發(fā)展為脂肪肝病。Ubr1作為一種E3泛素連接酶，其生理功能在結(jié)合必需氨基酸后被激活，催化Plin2脂滴保護(hù)蛋白的泛素化降解，從而緩解肝臟肝臟脂肪的積累。

研究人員通過Monolith無標(biāo)記互作實驗證明Ubr1可以區(qū)分必需和非必需氨基酸：精氨酸、賴氨酸等7種必需氨基酸能夠直接結(jié)合Ubr1并激活其功能。其中，亮氨酸 (Leu) 和異亮氨酸（Ile）與Ubr1結(jié)合能力最強, 親和力（Kd）接近于已報道的氨基酸受體 (Sestrin2/CASTOR1)；與之相對，非必需的纈氨酸（Val）無法結(jié)合Ubr1。

這些結(jié)果也在細(xì)胞水平實驗中得到驗證：在食物中補充亮氨酸或異亮氨酸，能夠明顯緩解由禁食誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)Plin2蛋白水平升高和脂肪積累。該研究表明，補充這兩種必需氨基酸在預(yù)防由營養(yǎng)不良導(dǎo)致的脂肪肝病中具有重要作用，Ubr1蛋白也是非酒精性脂肪肝病的潛在治療靶點。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.01.021

02

上海中醫(yī)藥大學(xué)屈祎課題組

結(jié)腸癌Wnt/β-catenin信號通路中藥小分子抑制劑

Wnt/β-catenin信號通路是公認(rèn)的腫瘤驅(qū)動因子，但β-catenin缺乏常見的小分子結(jié)合深疏水口袋，是個典型的“不可成藥”蛋白。2022年2月1日，上海中醫(yī)藥大學(xué)屈祎課題組在Cell Reports在線發(fā)表了題為"Liquidambaric acid inhibits Wnt/β-catenin signaling and colon cancer via targeting TNF receptor-associated factor 2"?的研究論文。本研究發(fā)現(xiàn)中藥路路通活性分子路路通酸 (LDA) 抑制Wnt信號通路和結(jié)腸癌，并利用蛋白質(zhì)譜技術(shù)找到了LDA的潛在靶標(biāo)蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 (TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)。

接下來研究人員使用Monolith分子互作儀驗證了TRAF2與LDA的直接相互作用（左圖）。為了進(jìn)一步探究LDA的結(jié)合位點，研究人員表達(dá)了不同結(jié)構(gòu)域的GFP標(biāo)簽蛋白直接在細(xì)胞裂解液中檢測。結(jié)果顯示LDA與缺少TRAF-C domain以及刪除TRAF-C domain 408–431氨基酸（△408–431）的蛋白間并無相互作用，僅與TRAF-C domain（TRAF2-TC）作用（右圖）。

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110319

03

北京大學(xué)杜鵬課題組

植物免疫蛋白通過挽救miRNA缺陷實現(xiàn)廣譜抗腫瘤反應(yīng)

2022年5月26日，北京大學(xué)杜鵬課題組在Cell在線發(fā)表了題為"A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency"?的研究論文。

該研究發(fā)現(xiàn)，在不同的人類原發(fā)性癌癥樣本和癌癥細(xì)胞系中，不能有效結(jié)合AGO2復(fù)合體的3’末端短1-nt的miRNA異構(gòu)體廣泛積累。異位表達(dá)的植物免疫蛋白RDR1通過其單核苷酸加尾修飾這些AGO2游離出的miRNA雙鏈異構(gòu)體，以重新激活有缺陷的miRNA通路，從而特異性阻斷實體瘤和白血病中癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。作者發(fā)現(xiàn)3'末端短1-nt的miRNA異構(gòu)體廣泛積累，而這些異構(gòu)體相比于2-nt懸垂的異構(gòu)體與AGO2的親和力更低。

作者在這里分別使用了EMSA與Monolith互作實驗進(jìn)行了驗證，這種短1-nt的異常miRNA不能有效進(jìn)入AGO2中，并且不穩(wěn)定，與不同腫瘤中的miRNA劑量減少有關(guān)。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.030

結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué)

04

北京大學(xué)毛有東課題組

蛋白酶體與去泛素化酶動態(tài)調(diào)控機制

2022年4月27日，北京大學(xué)毛有東課題組在?Nature?在線發(fā)表了題為"USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM"?的研究論文。

研究人員通過時間分辨冷凍電鏡技術(shù)，揭示了與去泛素化酶動態(tài)調(diào)控人源蛋白酶體（proteasome）的機制。去泛素化酶USP14通過可逆結(jié)合蛋白酶體26S被激活，剪切底物上的泛素鏈，被認(rèn)為是一個潛力巨大的癌癥和神經(jīng)退行性疾病的靶標(biāo)。北京大學(xué)毛有東教授團(tuán)隊通過時間分辨冷凍電鏡技術(shù)，揭示了與去泛素化酶動態(tài)調(diào)控人源蛋白酶體的機制。

在闡述USP14被蛋白酶體26S激活的機制的過程中，研究團(tuán)隊利用Monolith分子互作儀檢測了超大復(fù)合物蛋白酶體26S與USP14的相互作用，并在溶液體系中輕松檢測三元互作，驗證了底物對于USP14-26S親和力的影響。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8

05

清華大學(xué)Jiang Xin課題組

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑

人類葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUTs的表達(dá)升高，尤其是GLUT1和GLUT3，與促進(jìn)癌細(xì)胞的過度增殖相關(guān)，因此GLUT抑制劑具有潛在的抗癌治療作用。2022年5月12日，清華大學(xué)Jiang Xin及普林斯頓大學(xué)顏寧課題組共同通訊在Nature Communications?在線發(fā)表了題為"Molecular basis for inhibiting human glucose transporters by exofacial inhibitors"?的研究論文。該研究報告了一種 GLUT3 的變體GLUT3exo，可用于篩選和驗證外表面抑制劑。

隨后研究團(tuán)隊鑒定了一種外表面 GLUT3 抑制劑 SA47，并通過Monolith分子互作儀檢測SA47與GLUT3及其突變體的相互作用，驗證了晶體結(jié)構(gòu)中揭示的抑制劑作用位點。該研究為發(fā)現(xiàn)用于治療開發(fā)的 GLUTs 表面抑制劑提供了結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。Monolith分子互作儀檢測不依賴于分子量變化，非常適合于小分子互作的檢測。

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30326-3

06

北京生命科學(xué)研究所鄭三多課題組

多巴胺受體與配體的識別機制

多巴胺受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是各種精神神經(jīng)疾病的重要治療靶點。2022年6月8日，北京生命科學(xué)研究所鄭三多課題組Nature Communications在線發(fā)表了題為"Ligand recognition and biased agonism of the D1 dopamine receptor"?的研究論文。本研究通過冷凍電鏡技術(shù)揭示了D1多巴胺受體(D1R)-Gs復(fù)合物的三個結(jié)構(gòu)。

文中揭示了D1R有兩個單獨的結(jié)合位點可容納fenoldopam分子，分別位于正位結(jié)合袋(OBP)和擴展結(jié)合袋(EBP)，并通過Monolith分析得到與結(jié)構(gòu)觀察一致的結(jié)果。對于親和力不同的雙結(jié)合位點的靶標(biāo)分子與配體相互作用，使用Monolith分析軟件可分別擬合計算不同結(jié)合位點的親和力。

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30929-w

07

四川大學(xué)華西醫(yī)院楊勝勇課題組

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）- 大麻素受體CB1獨特的變構(gòu)調(diào)節(jié)機制

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量最高的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）之一，大麻素受體CB1是治療焦慮、肥胖、疼痛和神經(jīng)退行性疾病等諸多疾病的潛在藥物靶點。前期研究發(fā)現(xiàn)，CB1的變構(gòu)結(jié)合位點（allosteric site）為CB1調(diào)控藥物的開發(fā)提供了新方向。但是，CB1變構(gòu)調(diào)節(jié)的具體分子機制尚不清楚，嚴(yán)重阻礙了變構(gòu)藥物的研發(fā)。

2022年5月30日，四川大學(xué)華西醫(yī)院楊勝勇課題組在Nature Chemical Biology在線發(fā)表了題為"Molecular mechanism of allosteric modulation for the cannabinoid receptor CB1"?的研究論文。四川大學(xué)華西醫(yī)院楊勝勇和邵振華團(tuán)隊采用晶體衍射與冷凍電鏡技術(shù)，成功解析出CB1與變構(gòu)調(diào)節(jié)劑ZCZ011以及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Gi相互作用的精細(xì)結(jié)構(gòu)，在CB1變構(gòu)調(diào)節(jié)機制研究領(lǐng)域取得重大進(jìn)展。

研究者通過對CB1序列進(jìn)行點突變、片段插入等一系列改造，成功表達(dá)出可結(jié)晶的CB1蛋白。接下來又通過Monolith分子互作儀快速確認(rèn)了經(jīng)過序列優(yōu)化的CB1蛋白仍然具有與ZCZ011的結(jié)合能力。Monolith檢測時無需固定樣品，直接在溶液中檢測，可以避免固定對膜蛋白等脆弱樣品活性的影響。

https://doi.org/10.1038/s41589-022-01038-y

植 物 科 學(xué)

08

北京大學(xué)瞿禮嘉課題組

植物防止多精受精的分子機制

2022年1月20日，北大生命科學(xué)學(xué)院瞿禮嘉課題組在Science在線發(fā)表了題為"RALF peptide signaling controls the polytubey blockin Arabidopsis"?的研究論文，揭示了擬南芥中通過限制多花粉管靶向胚珠（多個花粉管到達(dá)一個胚珠）來防止多精受精的分子機制。植物是如何限制數(shù)以百計的花粉管進(jìn)入同一個胚珠，防止多精受精的呢？當(dāng)受精失敗后又如何進(jìn)行“受精補償”呢？

作者研究發(fā)現(xiàn)位于花柱道隔膜處(雌性)表達(dá)的FERONIA、ANJEA和HERCULES受體與花粉管（雄性）特異性分泌的RALF6、7、16、36和37小肽配體相互作用來建立阻止“多花粉管穿出”的“屏障”，只允許一根花粉管靶向胚珠?；ǚ酃苓M(jìn)入胚珠，爆裂釋放精子后，RALF小肽迅速減少，進(jìn)而解除花柱道隔膜處的“屏障”。從而在受精失敗時，可使第二根花粉管穿出花柱道，進(jìn)行受精補償。

研究團(tuán)隊使用Monolith分子互作儀對RALF6和RALF36與受體FER、ANJ和HERK1的親和力進(jìn)行測定，快速準(zhǔn)確的驗證了RALF6/36是受體FER、ANJ和HERK1的配體。

https://doi.org/10.1126/science.abl4683

09

北京大學(xué)李毅課題組

微量元素銅增強水稻抗病毒分子機制

銅是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑，然而銅對病毒入侵的反應(yīng)機制尚不清楚。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毅課題組在?Science Advances?在線發(fā)表了題為?"The key micronutrient copper orchestrates broad-spectrum virus resistance in rice"?的研究論文。課題組之前的研究表明，SPL9介導(dǎo)的miR528轉(zhuǎn)錄激活為已建立的AGO18- miR528 -?L-?AO抗病毒防御增加了一個調(diào)控層。研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+通過抑制SPL9的蛋白水平來抑制miR528的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而提高ROS水平，增強AO積累量及其酶活，從而加強抗病毒反應(yīng)，闡明了銅穩(wěn)態(tài)的分子機制、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及SPL9-miR528-AO抗病毒途徑。

為了檢測SPL9和Cu2+之間的直接相互作用，作者純化了SPL9 DNA結(jié)合區(qū)域（SPL9 SBP），使用Monolith分子互作儀檢測其與Cu2+的互作。結(jié)果顯示SPL9 SBP直接與Cu2+結(jié)合，但不與Ca2+結(jié)合。

https://doi.org/10.1126/sciadv.abm0660

10

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊淑華課題組

低溫特異鈣信號的感知和應(yīng)答機制

暴露在寒冷的環(huán)境中會觸發(fā)細(xì)胞質(zhì)Ca2+的激增，導(dǎo)致植物的轉(zhuǎn)錄重編程。然而，Ca2+信號是如何被感知和傳遞到下游的低溫信號通路仍然是未知的。2022年6月29日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊淑華及丁楊林課題組共同通訊在?Science Advances?在線發(fā)表了題為"CPK28-NLP7 module integrates cold-induced Ca2+ signal and transcriptional reprogramming in Arabidopsis"?的研究論文。研究發(fā)現(xiàn)，鈣依賴性蛋白激酶28 (CPK28)啟動了一個磷酸化級聯(lián)，從而作用于低溫誘導(dǎo)Ca2+信號下游的轉(zhuǎn)錄重編程。這項研究闡明了一種先前未知的機制，揭示了植物從質(zhì)膜到細(xì)胞核的快速感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)低溫信號的關(guān)鍵策略。

研究中，作者通過Monolith分子互作儀檢測到CPK28可直接與Ca2+結(jié)合，而CPK28 EF-hand位點突變蛋白CPK28EFm與Ca2+親和力降低了6倍，證明了EF-hand對結(jié)合Ca2+非常重要。

https://doi.org/10.1126/sciadv.abn7901

新一代分子互作檢測儀?

德國NanoTemper公司自2010年推出第一款基于微量熱泳動技術(shù)的Monolith分子互作儀。隨著工業(yè)用戶的增多且對高通量檢測的需求越來越迫切，NanoTemper公司于2014年推出了自動化的檢測儀器Monolith NT.Automated?；谟脩舻姆答仯?020年對該產(chǎn)品線進(jìn)行了全面升級，推出了全新的Monolith系列儀器。

產(chǎn)品特點：

• 僅需微量樣品，即可直接在溶液中測定分子間結(jié)合。

• 無需固定，不受檢測樣品種類的限制。

• 檢測速度快、測量范圍廣 (Kd?: 從pM到mM)。

• 儀器操作簡單，無需繁瑣的清洗維護(hù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Qi Y, Ding L, Zhang S, Yao S, Ong J, Li Y, et al. A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency. Cell. 2022 2022/05/26/;185(11):1888-904.e24.

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[3] Zhang Y, Lin S, Peng J, Liang X, Yang Q, Bai X, et al. Amelioration of hepatic steatosis by dietary essential amino acid-induced ubiquitination. Molecular Cell. 2022 2022/04/21/;82(8):1528-42.e10.

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