前言

2020 年 8月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院范先群教授、谷平教授為共同通訊作者，在 Cell Death & Differentiation (IF: 10.717) 發(fā)表了題為“CircRNA-vgll3 promotes osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells via modulating miRNA-dependent integrin α5 expression”的研究論文，報(bào)道了 circRNA-vgll3 調(diào)控脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制。

張丹丹博士為第一作者。文章中 circRNA 測(cè)序和分析由歐易生物協(xié)助完成。

研究背景

骨再生修復(fù)領(lǐng)域種子細(xì)胞問(wèn)題一直未能得到很好的解決。由于來(lái)源廣泛和容易獲得，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）成為骨再生醫(yī)學(xué)中主要的種子細(xì)胞之一，然而有限的成骨分化能力阻礙了其在骨缺損修復(fù)中的臨床應(yīng)用潛能。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，circRNA 參與了干細(xì)胞/祖細(xì)胞的命運(yùn)決定，但它們?cè)诟杉?xì)胞/祖細(xì)胞成骨中的具體作用仍鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究重點(diǎn)關(guān)注 ADSC 成骨分化中 circRNA 的作用機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

本研究表明，來(lái)源于 vgll3 基因座的 circRNA-vgll3 顯著增強(qiáng)了脂肪干細(xì)胞的成骨分化；沉默 circRNA-vgll3 則顯著降低 ADSCs 的成骨能力。研究表明，circRNA-vgll3 通過(guò) circRNA-vgll3/miR-326-5p/整合素α5 (Itga5) 途徑在 ADSC 成骨中起作用：Itga5 促進(jìn) ADSC 成骨分化，miR-326-5p 抑制 Itga5 翻譯，CircRNA-vgll3 在細(xì)胞質(zhì)中可以直接吸附 miR-326-5p 并抑制其活性以促進(jìn)成骨分化。

此外，對(duì) circRNA-vgll3 修飾的 ADSCs 復(fù)合 CPC 支架在修復(fù)大鼠標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型中的安全性和有效性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明 circRNA-vgll3 能增加骨礦物質(zhì)密度、骨小梁數(shù)量與新骨體積，顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

研究結(jié)果

1. ADSCs 中 circRNA-vgll3 的特征

從大鼠體內(nèi)分離脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 ADSCs，利用 BMP2 對(duì) ADSCs 進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，然后對(duì)誘導(dǎo)/非誘導(dǎo)的 ADSC 進(jìn)行 circRNA 測(cè)序。按照來(lái)源于外顯子、表達(dá)量 RPM > 0.1、有 miRNA 靶位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出 11 個(gè) circRNA（圖 a）。其中 circRNA-vgll3 來(lái)自于已報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和成脂分化決定基因 vgll3 的第 3 個(gè)外顯子（圖 c）。

利用反向引物、Sanger 測(cè)序、RNaseR 處理、放線菌素 D 處理證實(shí) circRNA-vgll3 確實(shí)具有 circRNA 特性（圖 d-h）。

RT-PCR 顯示，circRNA-vgll3 表達(dá)量在 BMP2 誘導(dǎo)的 ADSC 成骨分化中逐漸上升，在骨組織發(fā)育中也明顯上升（圖 i-j）。核質(zhì)分離和 FISH 實(shí)驗(yàn)表明，circRNA-vgll3 主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖 k-n）。

2. circRNA-vgll3 正向調(diào)控 ADSC 的成骨分化

在 ADSC 中過(guò)表達(dá) circRNA-vgll3，RT-PCR 和 WB 檢測(cè)顯示成骨 marker 基因均顯著上調(diào)（圖 c-e）；ALP 和 ARS 染色顯示 circRNA-vgll3 過(guò)表達(dá)促進(jìn)了 ALP 活性和鈣沉積（圖 f-i），這都是成骨分化的標(biāo)志。knockdown circRNA-vgll3 則會(huì)引起相反的變化趨勢(shì)。以上結(jié)果表明 circRNA-vgll3可以促進(jìn) ADSC 的成骨分化能力。

3. miR-326-5p 通過(guò)靶向 Itga5 調(diào)控 ADSC 的成骨分化

分析顯示 circRNA-vgll3 上具有兩個(gè) miR-326-5p 的靶向位點(diǎn)。RT-PCR 顯示在 BMP2 誘導(dǎo)的 ADSC 成骨分化過(guò)程中 miR-326-5p 表達(dá)量下調(diào)（圖 a）。

RT-PCR 和 WB 檢測(cè)在 ADSC 中過(guò)表達(dá) miR-326-5p 導(dǎo)致成骨 marker 基因均顯著下降；knockdown miR-326-5p 則導(dǎo)致相反的變化（圖 d-e），表明 miR-326-5p 可以抑制ADSC 的成骨分化能力。

進(jìn)一步研究 miR-326-5p 所靶向的 mRNA，靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示它可以靶向 213 個(gè) mRNA（圖 g）；上述 BMP2 誘導(dǎo)的 ADSC 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，其中只有 Itga5、CRY2、Mapk3 基因隸屬于 ADSC 成骨相關(guān) KEGG 通路中。在 ADSC 中過(guò)表達(dá)/knockdown miR-326-5p，只有 Itga5 表達(dá)量發(fā)生顯著改變，并且在成骨分化的 0、2、5、7 天呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性變化（圖 h-j）。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí) miR-326-5p 可以直接靶向結(jié)合到 Itga5 的 3’-UTR 區(qū)域（圖 n-o）。

并且抑制 Itga5 表達(dá)，同樣會(huì)導(dǎo)致成骨 marker 基因的表達(dá)下調(diào)（圖 p-q）。以上結(jié)果表明miR-326-5p 可以通過(guò)靶向 Itga5 調(diào)控 ADSC 的成骨分化。

4. CircRNA-vgll3 通過(guò) miR-326-5p 上調(diào) Itga5 的表達(dá)

circRNA-vgll3 上具有 miR-326-5p 的 2 個(gè)靶向結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明 miR-326-5p 可以通過(guò)這 2 個(gè)位點(diǎn)直接結(jié)合 circRNA-vgll3（圖 a-b）。利用靶向 circRNA-vgll3 的探針進(jìn)行 RNA pull down，RT-PCR 顯示探針可以顯著富集 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p（圖 c-d）。利用靶向 Ago2 蛋白的抗體進(jìn)行 RIP 實(shí)驗(yàn)，RT-PCR 顯示可以顯著富集 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p（圖 e-g）。FISH 顯示 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p 也共同定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖 h-i）。

ADSCs 中成骨 marker 基因和 Itga5 基因在 circRNA-vgll3 knockdown 時(shí)會(huì)顯著下調(diào)，但同時(shí) knockdown miR-326-5p 又會(huì)得以恢復(fù)（圖 j-k）。如果同時(shí)過(guò)表達(dá) circRNA-vgll3 和 knockdown Itga5，會(huì)抑制由 circRNA-vgll3 過(guò)表達(dá)所引起的 成骨 marker 基因的上調(diào)（圖 l）。綜合以上結(jié)果表明，circRNA-vgll3 可以通過(guò) miR-326-5p 上調(diào) Itga5 的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn) ADSC 成骨分化的作用。

5. circRNA-vgll3 調(diào)節(jié)體內(nèi)骨形成

為了研究 circRNA-vgll3 在體內(nèi)的作用，對(duì) circRNA-vgll3 修飾的 ADSCs 復(fù)合 CPC 支架在修復(fù)大鼠標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型中的安全性和有效性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá) circRNA-vgll3 的 ADSCs，能明顯增加骨礦物質(zhì)密度、骨小梁數(shù)量與新骨體積，顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。

研究結(jié)論

本研究報(bào)道了 circRNA-vgll3 調(diào)控脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的分子機(jī)制：circRNA-vgll3 在細(xì)胞質(zhì)中直接吸附 miR-326-5p 以抑制其活性，使受到 miR-326-5p 所靶向抑制的 Itga5 蛋白表達(dá)水平上升，進(jìn)而促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。本研究揭示了 circRNA-vgll3 在新骨形成中的重要作用與機(jī)制，為臨床上骨缺損修復(fù)難題的解決提供了新思路。

參考文獻(xiàn)

Zhang D, Ni N, Wang Y,?et al. CircRNA-vgll3 promotes osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells via modulating miRNA-dependent integrin α5 expression.?Cell Death & Differentiation?2020; doi:10.1038/s41418-020-0600-6.

說(shuō)明：本文源自歐易生物微信公眾號(hào)