????????上次小編主要介紹了低生物量比如口腔、陰道等樣本的常見(jiàn)微生物和污染物，但是測(cè)序技術(shù)的高靈敏度也放大了樣本中DNA污染的影響，那么對(duì)于低生物量的樣本如何進(jìn)行污染控制就至關(guān)重要了~

????????2019年在《Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations》文獻(xiàn)[1]中率先提出了針對(duì)低生物量樣品的污染控制理論，主要是低生物量樣品污染處理的詳細(xì)流程，簡(jiǎn)化了污染的處理方法，如下是詳細(xì)描述：

01

減少污染的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：?

樣品中的 DNA 在潔凈室環(huán)境中提取，使用超凈試劑盒和試劑，并在不同的指定區(qū)域進(jìn)行 PCR 前后實(shí)驗(yàn)。

02

控制污染 DNA

記錄陰性對(duì)照樣本，如：不同國(guó)家地域，不同醫(yī)院，不同類型的樣本，批次來(lái)源（地址來(lái)源、DNA 提取批次，PCR 擴(kuò)增批次和測(cè)序文庫(kù)編號(hào)）。把陰性對(duì)照納入每個(gè)批次類型，能夠檢測(cè)不同類型的批次效應(yīng)。同時(shí)提出了RIDE checklist，目的是提供給研究者一個(gè)可參照的開(kāi)展低微生物量樣本的微生物組研究的最低標(biāo)準(zhǔn)檢查表

這個(gè)檢查表包括四部分內(nèi)容：

01

Report??設(shè)計(jì)用于減少污染并評(píng)估污染影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法；

02

Include??包括評(píng)估污染DNA的控制措施。每批取樣、核酸提取以及擴(kuò)增必須包括一種類型的陰性對(duì)照(取樣空白對(duì)照、DNA提取空白對(duì)照和無(wú)模板擴(kuò)增對(duì)照)；

03

Determine??通過(guò)將生物樣本與對(duì)照進(jìn)行比較來(lái)確定污染程度；

04

Explore??探索每項(xiàng)研究中的污染菌群，并報(bào)告它們對(duì)生物樣本解釋的影響。

其實(shí)了解了這么多，目的是對(duì)低生物量微生物群落研究提出一些建議，來(lái)盡量避免污染[2-3]:

1. 盡可能通過(guò)選擇樣品類型、過(guò)濾或濃縮使初始樣品生物量最大化。如果微生物負(fù)荷小于大約103至104個(gè)細(xì)胞，由于污染占主導(dǎo)地位，可能無(wú)法獲得可靠的結(jié)果。

可以利用革蘭氏染色、熒光原位雜交(FISH)、qPCR或其他測(cè)序之前DNA定量的方法來(lái)優(yōu)化結(jié)果。

2.在樣品采集時(shí)將污染的風(fēng)險(xiǎn)降至最低。

3.每批樣品，每種提取試劑盒和每種PCR試劑盒，都進(jìn)行陰性對(duì)照與目標(biāo)環(huán)境樣品同時(shí)進(jìn)行收集處理及測(cè)序。

4. 樣品應(yīng)以隨機(jī)順序處理，以避免產(chǎn)生錯(cuò)誤的模式，理想情況下應(yīng)重復(fù)進(jìn)行，應(yīng)使用不同的試劑盒/試劑批次進(jìn)行處理。

5.應(yīng)記錄使用哪個(gè)試劑盒處理哪個(gè)樣品，以便可以將特定試劑盒批號(hào)的污染追溯到最終數(shù)據(jù)集。

6. 陰性對(duì)照樣品定量應(yīng)在處理的各個(gè)過(guò)程中都進(jìn)行，以監(jiān)測(cè)污染的發(fā)生。

7.測(cè)序后，要注意陰性對(duì)照中的分類單元，統(tǒng)計(jì)上與特定批次試劑相關(guān)的分類單元，以及生物學(xué)上無(wú)意義的分類單元，與之前報(bào)道的污染物相一致的分類單元。

8. 如果認(rèn)為可疑污染的菌群確實(shí)存在有意義，則應(yīng)該使用不同批次的DNA提取試劑盒/試劑進(jìn)行重復(fù)測(cè)序，理想情況下，應(yīng)該用非測(cè)序方法(如傳統(tǒng)培養(yǎng)或使用適當(dāng)?shù)奶结樳M(jìn)行原位雜交)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)他們的真實(shí)存在。

參考文獻(xiàn)

[1] Eisenhofer R,Minich JJ,Marotz C, et al. Contamination in Low Microbial Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations. Trends Microbiol. 2019

[2] Salter S J, Cox M J, Turek E M, et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.BMC biology, 2014

[3] Nejman D,Livyatan I,Fuks G, et al. The human tumor microbiome is composed of tumor type-specific intracellular bacteria. Science. 2020