喵喵 | 5-3 目的基因的篩選與獲取

1??基因工程基本操作概述

基因工程的基本操作程序：

1. 目的基因的篩選與獲取
2. 基因表達載體的構建
3. 將目的基因導入受體細胞
4. 目的基因的檢測與鑒定

1. 目的基因的定義及結構

（1）目的基因的定義及種類

在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因就是目的基因。根據不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指編碼蛋白質的基因，

如與生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因。例如培育轉基因抗蟲棉的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因。

編碼區(qū)：能夠轉錄為相應的信使RNA，進而指導蛋白質的合成的區(qū)段。

非編碼區(qū)：在編碼區(qū)的上游和下游，不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質的區(qū)段。有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，主要包括啟動子（含RNA聚合酶的結合序列）、終止子等。

【提問】

調控轉錄（基因非編碼區(qū)）

• 啟動子、終止子

調控翻譯（mRNA）

• 起始密碼子、終止密碼子

例題1

下列有關基因結構的敘述，正確的是

A. 真核細胞的基因中，編碼區(qū)中的內含子不編碼蛋白質?

B. 原核細胞的基因中，不包含非編碼區(qū)

C. 非編碼區(qū)是兩個基因之間沒有遺傳效應的區(qū)段【非編碼區(qū)指的是基因內部上游、下游、啟動子、終止子，算是基因的結構；沒有遺傳效應的是基因和基因之間的非基因序列】

D. 終止子是翻譯終止的信號，阻礙RNA聚合酶的移動【轉錄】

2. 篩選合適的目的基因

隨著測序技術的發(fā)展，以及序列數據庫（如GenBank），序列對比工具（如BLAST）等的應用，越來越多的基因的結構和功能為人們所知，所以從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。

3. 目的基因的獲取方法

根據目的基因的有關信息，獲取目的基因。

從細胞中分離目的基因

• 直接從供體生物細胞中分離目的基因（原核）
• 方法一
• 從基因文庫中分離目的基因（真核）
• 方法二

人工合成目的基因

• 化學合成法（目的基因序列完全已知）
• 方法三
• PCR（DNA片段序列完全已知或至少其兩端20bp左右序列已知以便設計引物）
• 方法四
• 反轉錄法：常用RT（反轉錄）—PCR法
• 方法五

【方法一：直接從供體生物細胞中分離目的基因】

最常用的方法是：“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。

適用對象：從簡單的基因組中分離目的基因，如原核基因、質?；虿《尽?/p>

具體操作：用限制酶將供體細胞的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在受體細胞中大量復制（即擴增），從中找出含有目的基因的細胞（菌落原位雜交法、基因產物檢測法等）。

【方法二：從基因文庫中分離目的基因】

基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因。

分為基因組文庫和部分基因文庫（如cDNA文庫）

【注意】

1. 真核生物基因一般從cDNA文庫獲取。
2. 如果想獲得胰島素基因，不能從胰島A細胞cDNA文庫中獲取?

例題2

利用人胰島B細胞構建cDNA文庫，然后通過核酸分子雜交技術從中篩選目的基因，篩選過程如下圖所示。下列說法錯誤的是

A. cDNA文庫的構建需要用到逆轉錄酶【mRNA→cDNA】

B. 圖中的菌落是通過稀釋涂布法獲得的【確實比較均勻】

C. 核酸分子雜交的原理是堿基互補配對

D. 從該文庫中可篩選到胰高血糖素基因【cDNA文庫中的胰島B細胞中，沒有胰高血糖素基因】

例題3

下列關于基因文庫的說法中，不正確的是

A. 某果蠅X染色體上的所有基因組成的文庫是部分基因文庫

B. cDNA文庫中的基因可以在不同物種間進行交流【cDNA文庫沒有內含子】

C. 取出果蠅某細胞中全部mRNA，通過反轉錄產生的全部DNA片段稱該果蠅的基因組文庫【反轉錄得到的是cDNA文庫】

D. 可以根據基因的堿基序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因

【方法三：化學合成法】

1. 適用對象：長度短且堿基序列已知的DNA的合成例如，合成PCR的引物、基因探針、人工接頭等。
2. 根據已知的氨基酸序列合成DNA：

蛋白質的氨基酸序列 —推測→ mRNA的核苷酸序列 ―推測→ 目的基因化學核苷酸序列 —化學合成→ 目的基因

【方法四：利用PCR獲取和擴增目的基因】

1. 前提：DNA片段序列完全已知或至少其兩端20bp左右序列已知以便設計引物
2. 過程：90℃以上（變性）→50℃左右（復性）→72℃左右（延伸）
3. 條件：模板DNA，dNTP，引物，TaqDNA聚合酶，緩沖液，Mg2?。
4. 擴增DNA檢測方法：瓊脂糖凝膠電泳

【方法五：RT（反轉錄）—PCR法】

mRNA —逆轉錄酶→ 互補DNA（cDNA）—DNA聚合酶→ 雙鏈DNA（即目的基因）