摘要:腫瘤已成為威脅人類生命的一大殺手，目前主要采用手術(shù)和放、化療等手段進行治療，但由于放、化療的細胞選擇性差、毒副作用明顯且易引起腫瘤細胞產(chǎn)生耐受（/藥）性，不利于腫瘤的持續(xù)治療，因此亟待研發(fā)具有定向定位優(yōu)勢、毒副作用低的新型靶向藥物. 原位自組裝多肽能識別腫瘤部位的特異性高表達物質(zhì)，在腫瘤部位靶向性聚集形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)精準(zhǔn)和高效治療，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物. 本研究基于多肽原位自組裝的設(shè)計理念，利用溶酶體內(nèi)組織蛋白酶L的催化活性，設(shè)計了靶向溶酶體且能夠原位自組裝的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，研究了該分子的自組裝特性及抗腫瘤活性. 結(jié)果顯示，在體外酸性條件下，組織蛋白酶L能精準(zhǔn)切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子，其酶切產(chǎn)物Fmoc-FFR-OH自組裝形成長納米纖維結(jié)構(gòu)，對腫瘤細胞A375和SH-SY5Y均具有較好的殺傷作用. 該分子通過靶向溶酶體殺傷腫瘤細胞且對正常細胞的毒性較低，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物.
腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已嚴重威脅人類健康［1］. 目前腫瘤治療主要使用手術(shù)和放、化療，但放、化療通常毒副作用明顯、細胞選擇性差且易導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐受（/藥）性，不利于腫瘤的持續(xù)治療. 因此亟待研發(fā)具有靶向性且毒副作用小的新型抗腫瘤藥物. 抗腫瘤多肽因其活性高、毒性低且不易引起細胞產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)等優(yōu)點，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景. 然而，普通抗腫瘤多肽存在生物體內(nèi)的作用機制不明確、穩(wěn)定性差等問題，性能還需進一步提升.
多肽自組裝是多肽分子自發(fā)聚集形成有序結(jié)構(gòu)（如納米球、納米管、納米棒等）的過程，通過該過程，一方面可以提升多肽分子的穩(wěn)定性；另一方面，可賦予其特殊的生物學(xué)功能，如藥物控釋、細胞培養(yǎng)、組織工程支架等［2］. 一些具有特定形貌的多肽自組裝結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出優(yōu)良的抗腫瘤活性［3-6］，如Chen等［4］發(fā)現(xiàn)，CL-1多肽在組裝后對含有磷酯酰絲氨酸的磷脂膜具有較大的破壞作用，具有較好的抗腫瘤活性. KLVFF-交聯(lián)的透明質(zhì)酸納米纖維，表現(xiàn)出較好的抗胸腺癌細胞的發(fā)展和轉(zhuǎn)移性能［3］. 前期研究中，我們也發(fā)現(xiàn)短肽分子A9K形成的納米短棒能破壞腫瘤細胞的細胞膜，快速殺死腫瘤細胞［5-6］. 多肽分子的組裝過程主要依賴于分子內(nèi)/間各基團的靜電吸引、疏水作用、氫鍵以及范德華力等非共價作用力共同驅(qū)動，組裝過程容易受到外界環(huán)境（如pH、溫度、光照、離子強度等）的影響，從而導(dǎo)致組裝體微觀形貌或材料宏觀性質(zhì)發(fā)生改變. 基于此，科學(xué)家提出了“肽原位自組裝”的概念，即具有靶向性的前體肽分子在體內(nèi)特定靶點部位高效聚集，并在該部位特異性高表達的物質(zhì)誘導(dǎo)下，自組裝形成特定形貌的組裝體結(jié)構(gòu)［7-8］，從而行使特殊的生物學(xué)功能. 在不同腫瘤組織中，堿性磷酸酶、酪氨酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等生物酶的表達量增加，特定序列的多肽分子可在上述酶的催化作用下組裝形成特定形貌的納米結(jié)構(gòu)，殺死腫瘤細胞［9-13］，在腫瘤的精準(zhǔn)定位和靶向治療方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景.
溶酶體在分子伴侶熱休克蛋白70（heat shock cognate protein，HSC70）的參與下調(diào)控細胞內(nèi)自噬，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色［14-15］. HSC70可識別含有KFERQ序列的蛋白質(zhì)和多肽底物，并與溶酶體膜上的受體結(jié)合，介導(dǎo)底物進入溶酶體進行降解［16］. 溶酶體中含有多種水解酶，其中組織蛋白酶L（cathepsin L）是一種普遍表達的半胱氨酸蛋白酶，在降解多種生理蛋白底物方面具有較高的特異性［17］，能調(diào)控腫瘤細胞的生長［18］. 根據(jù)Schechter—Berger命名法，將酶切位點定義為P位點，其酶切序列為...P3-P2-P1-P1′-P2′-P3′...［19］，當(dāng)水解蛋白質(zhì)分子時，底物序列中的P2位點決定了cathepsin L的酶切特異性，一般其P2位為含有苯環(huán)的氨基酸時，cathepsin L的酶切效率較高［20］；同時當(dāng)P1位點為精氨酸（arginine，R），P2和P3位點為疏水性氨基酸殘基時，其酶切效率也能大大提升［21］. 通過溶酶體內(nèi)組織蛋白酶水解產(chǎn)生的氨基酸殘基可被腫瘤細胞利用，進行快速分裂增殖，因此可通過控制溶酶體的活性來達到抗腫瘤的目的［22］.
本研究利用腫瘤細胞內(nèi)溶酶體數(shù)量較多的微環(huán)境，基于多肽原位自組裝的設(shè)計理念，將溶酶體靶向序列與自組裝超短肽序列結(jié)合，設(shè)計了包含cathepsin L酶切位點的短肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，目的是使該分子既能靶向溶酶體，又能利用溶酶體內(nèi)cathepsin L的催化作用原位組裝形成新的組裝體結(jié)構(gòu)，選擇性殺傷腫瘤細胞. 通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）和原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）等儀器考察cathepsin L酶切前后肽分子質(zhì)量及組裝體微觀形貌的改變，并通過MTT法以及流式細胞儀等考察多肽對L929、A375及SH-SY5Y的細胞毒性. 結(jié)果表明，在體外酸性條件下，cathepsin L能夠精準(zhǔn)切割Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子，其酶切產(chǎn)物Fmoc-FFR-OH能在酸性環(huán)境中自組裝形成長纖維結(jié)構(gòu)，對腫瘤細胞A375以及SH-SY5Y均具有較好的殺傷作用. 該分子序列短、合成方便，能通過靶向溶酶體并在溶酶體酶的催化下原位組裝的機理殺傷腫瘤細胞，且對正常細胞的毒性較低，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物.
1　材料與方法
1.1　材料
多肽合成所需要的氨基酸、樹脂、1-羥基苯并三氮唑（HOBt）、1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）等；合成多肽所需溶劑如N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、二異丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）等購自博邁杰生物科技有限公司（珠海）；哌啶（piperidine）、乙醚購自西隴化工（上海）、乙腈購自Merck公司（美國）. Cathepsin L（來源于人肝臟，酶活≥0.5 U/mg）、1，4-二硫蘇糖醇（DTT）、 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍，MTT）購自Sigma-Aldrich公司（美國）；胰酶（trypsin）購自USA Xiasi Bio公司（美國）；Lyso-Tracker Red （溶酶體紅色熒光探針）購自碧云天生物技術(shù)有限公司（上海）；胎牛血清（FBS）購自四季青生物工程材料有限公司（杭州）；青鏈霉素購自瑞陽制藥有限公司（山東）；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司（美國）；RPMI-1640培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（山東）；其他生化試劑均購自國藥集團（上海）.
小鼠成纖維細胞（L929）、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（SH-SY5Y）、人惡性黑色素瘤細胞（A375）均購自中國科學(xué)院上海細胞庫. 其中SH-SY5Y 細胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37oC、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). L929、A375細胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37oC、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
1.2　多肽分子的合成
本實驗中使用的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH、Fmoc-FFR-OH采用Fmoc固相合成法，利用微波輔助多肽合成儀（Liberty 1型CEM公司，美國）合成. 多肽分子合成是由C端至N端進行，每連接一個氨基酸就執(zhí)行一次脫保護、活化、縮合步驟. 樣品合成結(jié)束后，連有多肽分子的樹脂在裂解液（95%（v/v）TFA、2.5%（v/v）超純水、2.5%（v/v）TIS）中室溫攪拌. 裂解產(chǎn)物再次抽濾，液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冰乙醚沉淀，采用乙醚清洗多次沉淀后冷凍干燥，即可得到多肽固體粉末. 多肽產(chǎn)品的純度采用MALDI-TOF-MS和C18反向-高效液相（reverse phase-high performance liquid chromatography， RP-HPLC）的方法進行鑒定.
1.3　多肽溶液的配制
稱取0.3735 mg Fmoc-FFRIKFERQ-OH多肽粉末，溶解在Hepes緩沖液中，溶液配制后需渦旋均勻并放入超聲波清洗器內(nèi)超聲使其充分溶解. 若超聲30 min后多肽分子仍未完全溶解，可繼續(xù)85℃水浴加熱2 h以促其溶解. 對于AFM實驗所用樣品，在室溫下放置7 d后進行掃描，以保證多肽分子可充分自組裝.
1.4　多肽的cathepsin L酶響應(yīng)性
首先配制酶促反應(yīng)緩沖液：1 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT、20 mmol/L 醋酸鈉緩沖液， 醋酸調(diào)pH至5.5. 酶促反應(yīng)前，將2 μl cathepsin L（≥0.5 U/mg）于48 μl緩沖液中活化30 min，取 50 μl新鮮配制的0.25 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH加入到上述緩沖液中，至酶切底物的終濃度為0.125 mmol/L，混合均勻后置于37℃水浴中，反應(yīng)0 min、30 min、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h后分別取樣進行質(zhì)譜檢測，分析酶解效率. 由于pH 5.5的條件下cathepsin L活力最為穩(wěn)定［23］，故酶切反應(yīng)在醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）中進行. 由于cathepsin L是含巰基的半胱氨酸蛋白酶，具有巰基激活效應(yīng)的二硫蘇糖醇（DTT）和乙二胺四乙酸（EDTA）都能夠有效提高cathepsin L活性［24］，因此在上述醋酸-醋酸鈉緩沖液中加入適量DTT和EDTA.
1.5　MALDI-TOF-MS實驗
MALDI-TOF-MS （Microflex型Bruker公司，德國）用來檢測多肽酶切反應(yīng)前后分子質(zhì)量的改變. 實驗所用基質(zhì)為α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA，Bruker）的TA30飽和溶液（由30% （v/v）乙腈、70%（v/v）0.1%TFA水溶液配制而成）. 分別取基質(zhì)上清液2.5 μl和樣品2.5 μl混合均勻，取2.5 μl混合均勻后的樣品點于靶板上，放置于通風(fēng)櫥中至樣品自然干燥. 實驗中采用延時引出和正離子反射模式檢測，激光波長337 nm，加速電壓19.0 kV，反射電壓20.0 kV，延時引出時間140 ns，激光頻率60 Hz，累加450次單次掃描結(jié)果作為質(zhì)譜圖.
1.6　AFM實驗
AFM（Nanoscope Iva型Nanoscope Iva公司，美國）是通過檢測待測樣品和微懸臂的原子間相互作用力來表征組裝體的形貌. 本實驗采用剝離的新鮮云母片表面作為基底，在上面滴加10 μl待測樣品，吸附約30 s后，用少量超純水沖洗云母片，并用氮氣吹干. 本實驗掃描過程中采用輕敲模式（tapping mode），掃描頻率1 Hz，掃描角度0°，掃描分辨率為512×512. 采用TESP-V2型單晶硅探針（Bruker），針尖半徑不大于10 nm，懸臂約 127 μm，胡克系數(shù)為42 N/m.
1.7　抗腫瘤活性檢測
采用MTT法檢測多肽對細胞增殖率的影響. 首先按1×104 cells/孔將L929、SH-SY5Y、A375細胞接入96孔細胞培養(yǎng)板，置于5% CO2培養(yǎng)箱37oC培養(yǎng)24 h后，加入配制好的多肽溶液. 加入培養(yǎng)基的孔作為對照組，設(shè)立相應(yīng)培養(yǎng)基但無細胞組作為空白組，每組設(shè)置6個孔重復(fù)，配制好的96孔細胞培養(yǎng)板放置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，4 h后棄除各孔中的全部液體，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩 10 min后置于酶標(biāo)儀（Spectra Max M2e型Molecular Devices公司，美國）中檢測490 nm處的吸光度（A490） 值，實驗至少重復(fù)3次以上. 根據(jù)下列公式計算細胞相對增殖率：

1.8　流式細胞檢測及熒光染色
采用流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）以及熒光染色檢測溶酶體膜結(jié)構(gòu)的變化. Lyso-Tracker Red是一種溶酶體紅色熒光探針，能通透細胞膜，可用于活細胞溶酶體特異性熒光染色. 按1×104 cell/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，加入配制好的多肽溶液在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后收集細胞，去除細胞培養(yǎng)液，加入37℃預(yù)溫育的Lyso-Tracker Red染色液，與37℃孵育細胞40 min. 隨后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸細胞，使用流式細胞儀（FACSCalibur型BD公司，美國）進行檢測.
熒光染色實驗同樣使用Lyso-Tracker Red進行檢測，按1×104 cell/孔接入96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，加入配制好的多肽溶液于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h. 然后去除細胞培養(yǎng)液，采用PBS洗滌3次，加入37℃預(yù)溫育的Lyso-Tracker Red染色液，與37℃孵育細胞40 min. 棄去上清液，采用PBS清洗3遍，使用倒置熒光顯微鏡（DMI300B型Leica公司，德國）進行檢測.
2　實驗結(jié)果
2.1　多肽分子設(shè)計及性質(zhì)表征
溶酶體可通過膜受體介導(dǎo)細胞自噬過程，引發(fā)細胞死亡，因此在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要的角色［14-15］. 進入溶酶體降解的蛋白質(zhì)分子具有一定的選擇性，一般含有KFERQ序列的蛋白質(zhì)分子能與溶酶體膜受體結(jié)合，進入溶酶體內(nèi)部［16］. 因此，在我們的研究中，采用KFERQ序列作為抗腫瘤肽的溶酶體靶向序列. 為使進入溶酶體的多肽分子能在溶酶體內(nèi)組織蛋白酶的催化下進行原位自組裝，在靶向肽的N端加入具有較強自組裝能力的超短肽Fmoc-FF序列［25］. 為使設(shè)計的分子具有溶酶體cathepsin L響應(yīng)性，在Fmoc-FF以及KFERQ兩個片段之間插入酶敏感性序列R↓I，設(shè)計序列為Fmoc-FFRIKFERQ-OH的多肽. 在該序列中，P1位點為親水性的R殘基，P2位點為含苯環(huán)的疏水性氨基酸，該設(shè)計能使cathepsin L的酶切效率較高且特異性較強［20-21］. 為驗證酶切產(chǎn)物的組裝性能，我們還合成了Fmoc-FFR-OH多肽.
通過MALDI-TOF-MS實驗分析，F(xiàn)moc-FFRIKFERQ-OH和Fmoc-FFR-OH多肽的相對分子質(zhì)量分別為1 495.0（［M+H］+）和692.5（［M+H］+），與理論計算的相對分子質(zhì)量（1 493.7和690.7）吻合（圖1a，b），同時，RP-HPLC實驗結(jié)果顯示，合成的多肽RP-HPLC譜圖中只有尖銳的單峰出現(xiàn)，對其峰面積積分可知多肽純度達到98%（圖1c，d），符合后續(xù)實驗要求.

2.2　Cathepsin L對Fmoc-FFRIKFERQ-OH的酶切效應(yīng)
為檢驗短肽Fmoc-FFRIKFERQ-OH對cathepsin L的酶響應(yīng)性，首先將cathepsin L置于醋酸鈉緩沖液中預(yù)活化30 min，然后加入 0.25 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH混合均勻后，37℃水浴不同時間后取樣，進行MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果如圖2所示. 反應(yīng)0 h時，在酶促反應(yīng)體系中，僅能檢測到Fmoc-FFRIKFERQ-OH單一樣品，其相對分子質(zhì)量為1 495.0（［M+H］+）（圖2a）. 當(dāng)反應(yīng)2 h后，酶切體系中開始出現(xiàn)相對分子質(zhì)量為692.7的酶切產(chǎn)物峰，該數(shù)值與Fmoc-FFR-OH一致（［M+H］+），但峰值較低，表明反應(yīng)產(chǎn)物的量非常少. 隨著反應(yīng)時間延長至4 h時，酶反應(yīng)體系中檢測到相對分子質(zhì)量為692.7、858.1的新產(chǎn)物峰（圖2b）. 其中，692.7為Fmoc-FFRIKFERQ-OH酶切產(chǎn)物Fmoc-FFR-OH（［M+H］+）的分子質(zhì)量，858.1為Fmoc-FFRIKFERQ-OH酶切產(chǎn)物NH2-IKFERQ-OH（理論相對分子質(zhì)量為819.9）［M+K］+的分子質(zhì)量. 當(dāng)反應(yīng)時間延長到12 h，相對分子質(zhì)量為692.6、858.0產(chǎn)物峰值均增強，而Fmoc-FFRIKFERQ-OH底物1495.0的峰值逐漸降低至零，說明此時Fmoc-FFRIKFERQ-OH已被酶切完全（圖2c）. 上述結(jié)果表明，在體外酸性條件下，我們設(shè)計的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH能被cathepsin L準(zhǔn)確切割為Fmoc-FFR-OH和NH2-IKFERQ-OH兩條短肽（圖2d）.

2.3　Fmoc-FFRIKFERQ-OH及其酶切產(chǎn)物的微觀組裝形貌
分別用pH 5.5、pH 7.2超純水配制5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH和5 mmol/L Fmoc-FFR-OH溶液，室溫下放置7 d使其充分自組裝，采用AFM檢測上述多肽的組裝形貌. 結(jié)果顯示，在酸性和中性條件下，F(xiàn)moc-FFRIKFERQ-OH均組裝成短棒狀納米結(jié)構(gòu)（圖3a，b），而Fmoc-FFR-OH于pH 5.5、pH 7.2條件下均形成長纖維狀結(jié)構(gòu)（圖3c，d）. 酶解后另外的產(chǎn)物KFERQ作為生物體內(nèi)廣泛存在的溶酶體信號序列，不具有生物毒性，在本研究中未檢測到其組裝體形貌.

2.4　多肽的抗腫瘤性能
上述研究表明，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH對cathepsin L酶具有高響應(yīng)性，其酶切產(chǎn)物Fmoc-FFR-OH可自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu). Yang等［26］指出多肽分子在細胞內(nèi)自組裝形成的納米纖維結(jié)構(gòu)能夠有效破壞細胞結(jié)構(gòu)，引發(fā)細胞死亡. 因此，我們采用MTT法檢測了該多肽對正常細胞L929、腫瘤細胞A375以及SH-SY5Y的細胞毒性. 結(jié)果顯示，F(xiàn)moc-FFRIKFERQ-OH對正常細胞L929的毒性較?。▓D4）. 當(dāng)作用于腫瘤細胞A375和SH-SY5Y時，隨著多肽濃度的增加，F(xiàn)moc-FFRIKFERQ-OH對A375和SH-SY5Y細胞的殺傷力逐漸增強，當(dāng)濃度增加至1 mmol/L時，其細胞死亡率分別為63.92%、73.44%，與對照相比，具有顯著性差異（圖4）. 因此，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH對腫瘤細胞A375和SH-SY5Y具有較強的殺傷作用，而對正常細胞具有較低的毒副作用.

質(zhì)譜及AFM實驗表明，多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH能夠被溶酶體內(nèi)的cathepsin L降解. 接下來，我們通過流式細胞術(shù)以及熒光染色實驗檢測多肽分子加入后細胞內(nèi)溶酶體結(jié)構(gòu)的變化情況. Lyso-Tracker Red能穿越細胞膜，高選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中，從而實現(xiàn)對于溶酶體的特異性熒光標(biāo)記. 對照組細胞染色后，溶酶體熒光強度較強（圖5d），此時細胞伸展為梭形，緊密地貼壁在孔板的底部（圖5a）. 當(dāng)加入0.5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH時，部分細胞變圓（圖5b），細胞內(nèi)溶酶體染色的熒光強度降低（圖5e）. 當(dāng)Fmoc-FFRIKFERQ-OH濃度繼續(xù)增加至1 mmol/L，溶酶體熒光強度基本消失，此時大部分細胞形態(tài)發(fā)生皺縮，且從細胞培養(yǎng)板板底脫離（圖5c）. MTT結(jié)果表明，該多肽濃度下，SH-SY5Y細胞的存活率僅為26.56%，表明大部分細胞已死亡.流式細胞儀結(jié)果顯示，對照細胞內(nèi)，溶酶體紅色熒光的陰性率為5.23%，說明絕大多數(shù)的溶酶體結(jié)構(gòu)是完整的. 當(dāng)細胞與0.5 mmol/L Fmoc-FFRIKFERQ-OH溫育48 h后，細胞紅色熒光的陰性率為16.60%，說明有部分細胞的溶酶體遭到破壞，當(dāng)將Fmoc-FFRIKFERQ-OH的濃度增加到1 mmol/L，細胞紅色熒光的陰性率升高為33.30%，說明大部分腫瘤細胞內(nèi)溶酶體結(jié)構(gòu)遭到破壞（圖5g~i），該實驗結(jié)果說明，F(xiàn)moc-FFRIKFERQ-OH多肽可通過誘導(dǎo)溶酶體破裂達到殺傷腫瘤細胞的目的. 而此濃度下MTT結(jié)果顯示細胞死亡率為73.44%，表明Fmoc-FFRIKFERQ-OH不僅通過溶酶體破壞途徑殺傷腫瘤，而且還存在其他誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的途徑.

3　討論
腫瘤治療一直以來都是人們需要攻克的難題，而近年來腫瘤耐藥性的出現(xiàn)使腫瘤治療更加困難. 原位自組裝多肽能夠靶向性地聚集在腫瘤部位，借助腫瘤部位局部溫度高、pH低以及某些生物酶高表達等微環(huán)境進行原位自組裝形成特定的納米結(jié)構(gòu)，與腫瘤細胞內(nèi)維持細胞形態(tài)的微管蛋白等結(jié)合，影響細胞的增殖和遷移，在腫瘤的精確定位和靶向治療方面表現(xiàn)出優(yōu)異的效果［9-10，27-28］.
溶酶體作為細胞的“自殺包”，調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展，可作為腫瘤治療的靶點［29］. 本文依據(jù)多肽原位自組裝的設(shè)計理念，將溶酶體靶向序列與cathepsin L的酶促反應(yīng)專一性結(jié)合起來，設(shè)計了可靶向溶酶體的多肽分子Fmoc-FFRIKFERQ-OH，該分子在中性條件下自組裝形成尺寸較小的短棒狀納米結(jié)構(gòu)（圖3），可通過細胞內(nèi)吞的方式進入腫瘤細胞內(nèi)部（圖6，Ⅰ），然后在溶酶體靶向序列KFERQ的指引下到達溶酶體（圖6，Ⅱ）. 溶酶體內(nèi)高活性的cathepsin L專一性地識別Fmoc-FFRIKFERQ-OH分子內(nèi)R↓I間的肽鍵，生成Fmoc-FFR-OH產(chǎn)物分子，而該分子可在酸性條件下自組裝形成長的納米纖維（圖3），當(dāng)溶酶體內(nèi)Fmoc-FFR-OH的含量達到一定閾值（圖6，Ⅲ），溶酶體膜溶脹，誘導(dǎo)腫瘤細胞程序性壞死（圖6，Ⅳ）. 與腫瘤細胞相比，正常細胞中溶酶體數(shù)量遠低于腫瘤細胞，因此Fmoc-FFRIKFERQ-OH對正常細胞表現(xiàn)為較低的毒性.

腫瘤的靶向治療已成為未來腫瘤治療的主要方向和突破口，原位自組裝多肽因其獨特性質(zhì)在腫瘤治療中呈現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和潛能，可利用腫瘤組織特異性高表達的成分誘導(dǎo)多肽在腫瘤部位聚集并發(fā)生原位組裝，形成穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，一方面克服了肽分子在細胞內(nèi)的不穩(wěn)定性，另一方面也增加了肽分子在局部組織的聚集，降低了對正常組織的毒副作用，從而達到精準(zhǔn)治療腫瘤的目的.
免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可刪除。