大家做完測序分析之后，一般都會(huì)做個(gè)簡單的qPCR驗(yàn)證一下，但是結(jié)果不符合預(yù)期，尤其是結(jié)果存在不一致的情況，尷尬了，該怎么辦呢？小編作為資深科研黨，被很多人問過類似問題。

下面，小編根據(jù)收到的問題做了歸類梳理，大家看看能否解答心中的疑惑。也歡迎大家留言評論自己遇到的科研問題，小編會(huì)定期答復(fù)，大家一起進(jìn)步??！

1?qPCR驗(yàn)證與RNA-Seq測序結(jié)果不一致，為什么？

兩種方法之間本身就存在差異，具體如下：

第一：兩者實(shí)驗(yàn)上存在差異。qPCR選擇的目的基因的擴(kuò)增區(qū)域、擴(kuò)增效率、qPCR試劑等原因均會(huì)影響最終的表達(dá)量結(jié)果；RNA-Seq測序可能存在的GC偏好等也會(huì)影響最終的表達(dá)量結(jié)果。

第二：數(shù)據(jù)分析上存在差異。由于RNA測序經(jīng)歷了建庫、測序和信息分析等復(fù)雜的過程，各種參數(shù)的改變通常會(huì)造成結(jié)果的差異。不同的數(shù)據(jù)庫，最后檢測到的基因和junction數(shù)目都不相同。這也可以部分解釋，有些老師用同樣的數(shù)據(jù)，在不同公司進(jìn)行分析，得出不同的結(jié)果。

所以使用qPCR驗(yàn)證的RNA-Seq定量結(jié)果，由于兩種技術(shù)本身的差異及表達(dá)量計(jì)算原理的差異，所以建議關(guān)注兩種基因表達(dá)的檢測結(jié)果變化趨勢總體是不是一致，具體表達(dá)量的值及差異倍數(shù)數(shù)據(jù)作為參考。

2 qPCR驗(yàn)證與RNA-Seq測序結(jié)果上下調(diào)不一致，怎么辦？

?先檢查是否存在以下這幾種情況：樣本對比關(guān)系弄反了、做驗(yàn)證的基因表達(dá)量偏低、沒有用測序的樣本來做驗(yàn)證等。這些都是比較常見的導(dǎo)致驗(yàn)證結(jié)果上下調(diào)不一致的原因。

?如果大部分基因都驗(yàn)證上了，只有少數(shù)基因不一致，那其實(shí)是很正常的現(xiàn)象。我們來看2015年BMC Genomics雜志的一篇RNA測序的文章的驗(yàn)證結(jié)果（Zhang W, Chen J, et al., Comparative transcriptomic analysis of immune responses of the migratory locust, Locusta migratoria, to challenge by the fungal insect pathogen, Metarhizium acridum. BMC Genomics. 2015 Oct 26;16(1):867.），這篇文章中驗(yàn)證的58個(gè)基因，有50個(gè)qPCR和RNA-Seq測序結(jié)果一致，一致性是86.2%，這個(gè)結(jié)果對于雜志來說，通常是可以接受的。

3 所篩選基因全部都驗(yàn)證不一致，怎么辦？

如果以上問題都不存在，您挑選的基因全部都驗(yàn)證不一致，那就拿起電話打給測序公司吧，得看一下數(shù)據(jù)分析是不是有問題。

好啦，困惑解答完畢~

祝大家年年行大運(yùn)，多發(fā)文章多中基金，沒事兒多來看看小編呀~