過表達載體！無縫克隆引物設計就用TaKaRa，3分鐘搞定一個方案！
以pEGFP-C1構建human p53 CDS過表達載體為例
1.與傳統(tǒng)的酶切連接一致的，我們先獲取插入片段以及載體的序列信息。
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1）Nucleotide: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
NCBI獲取基因序列（fasta）
獲取第一轉錄本CDS序列
經(jīng)TA克隆的目標基因序列直接使用測序結果進入下一步
2）SnapGene：http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files
SnapGene獲取載體圖譜序列
2.TaKaRa In-Fusion引物設計工具
在無縫克隆的過程中，最重要的就是需要設計一對合適的引物
1）打開TaKaRa官網(wǎng)：https://www.takarabiomed.com.cn/
選擇解決方案，點擊多能手In-Fusion的高級應用
2）頁面底端選擇In-Fusion工具箱
3）進入頁面后，選擇In-Fusion引物設計工具
4）引物設計：https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tools
5）在左側選擇需要設置參數(shù)
①選擇項目類型：克隆/突變
②輸入載體序列
③選擇載體線性化的方式，通常我們會選擇酶切的線性化方式
選擇酶切后會提示輸入限制性內切酶
④輸入插入片段
6）點擊生成引物，新彈出的頁面中會出現(xiàn)進行無縫克隆融合后的載體圖譜，右側是它的序列。
7）加載開放閱讀框視圖，檢查目標序列與GFP標簽是否融合
①找到GFP閱讀框
②找到p53閱讀框
③目標序列起始密碼與GFP不同框
④融合域出現(xiàn)GFP終止密碼，這是不允許的
因此說明，這個無縫克隆構建的方式，是沒有將目標序列比較好的融合到載體中。
8）返回上個設置參數(shù)頁面，將插入片段中與GFP標簽不能同框多余的堿基A去除后，重復之前的引物篩選。
查讀碼框是否融合，目標基因讀碼框是否移位
我們可以看到，在同一個讀碼框下，GFP標簽和目標序列完成了融合。
9）下拉后，可以看到用于執(zhí)行克隆的引物序列
標黃部分指引物中所存在的序列
選擇下載結果
10）解壓下載結果
打開表格CSV格式文件
兩條序列的信息、引物序列、TM值等等
就用TaKaRa網(wǎng)站，完成了引物設計。
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