本研究描述了一個名為BEHAV3D的系統(tǒng)，該系統(tǒng)旨在通過3D成像分析平臺和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，研究免疫細胞和癌癥患者腫瘤類器官的動態(tài)相互作用。應(yīng)用BEHAV3D實時追蹤了與癌癥患者衍生的實體腫瘤類器官一起培養(yǎng)的工程化T細胞（大于150,000個），確定了一個具有'super engager'行為的集群，其中包含具有強效連續(xù)殺傷能力的T細胞。本研究還探索了癌癥代謝組感應(yīng)工程T細胞（cancer metabolome-sensing engineered T cells, TEGs），并測定行為特異性基因，其中包括由super engager殺手TEG表達的一組27個基因（以前未用于描述過T細胞功能的基因）?？傊?，BEHAV3D是一種很有前途的工具，可用于表征細胞免疫療法的行為表型異質(zhì)性，并可能支持個性化實體瘤靶向細胞療法的優(yōu)化。

1. 3D實時跟蹤TEG靶向功效

基于多光譜、3D成像的平臺，設(shè)計了BEHAV3D，用于實時跟蹤細胞免疫療法對人腫瘤類器官培養(yǎng)物的。使用3D顯微鏡對類器官和TEG的共培養(yǎng)進行成像，然后對類器官和T細胞進行分割和跟蹤，再進行行為分類（圖1a-c）。將14名乳腺癌(BC)患者的PDO與TEG共培養(yǎng)，檢測到了TEG介導(dǎo)的殺傷效力的變化和隨著時間的推移不同的靶向動力學(xué)（圖1d-f）。在六種TEG敏感性最高的BC-PDO培養(yǎng)物中，觀察到源自不同亞型的原發(fā)性BC的培養(yǎng)物和轉(zhuǎn)移衍生的樣本。此外，在小鼠異種移植模型中，TEG控制體內(nèi)PDO衍生的乳腺腫瘤的生長（圖1g）。這提供了有利于TEG對抗實體瘤的臨床潛力的證據(jù)，特別是BC的靶向性。此外，細胞因子信號傳導(dǎo)和細胞外基質(zhì)組織都與對TEG治療的高敏感性相關(guān)（圖1h）。尤其是在TEG敏感性最高的兩種PDO培養(yǎng)物14T和13T中，TEG殺傷與1型干擾素（IFN-I）信號基因之間的關(guān)聯(lián)性最高。因此，PDO在培養(yǎng)中保持腫瘤特異性炎癥特征，表明它們在以患者特異性方式模擬細胞免疫治療反應(yīng)方面的效用。

圖1 通過多光譜3D實時成像和體內(nèi)TEG靶向檢測到的多種 BC亞型類器官的TEG功效

2. TEG在行為和殺傷潛力方面表現(xiàn)出高度的多樣性

BEHAV3D能實現(xiàn)單免疫細胞跟蹤（圖2a），應(yīng)用于BC PDO時，TEG可以分為九個具有獨特行為模式的亞群（圖2b-d）。模式從不活躍的行為（垂死的、靜態(tài)的和懶惰的）到活躍的運動和類器官參與，從而表現(xiàn)出高度的行為異質(zhì)性。使用行為分類器預(yù)測與具有不同TEG敏感性的BC PDO（34T、100T、27T、10T或13T；圖1f）共培養(yǎng)時TEG行為，來源于正常乳腺組織與TEG一起培養(yǎng)時，死亡很少（圖2e）。對于每種PDO培養(yǎng)物，TEG顯示出獨特的行為特征分布（圖2e），腫瘤參與增加類器官殺傷，而靜態(tài)、懶惰和中等的行為減少（圖 2f）。單個類器官死亡動力學(xué)與TEG參與之間的相關(guān)性表明，與其他類器官參與集群相比，超級參與者接觸的類器官被殺死的可能性最高（圖 2g）。

圖2 暴露于PDO的TEG的行為表現(xiàn)出高度的多樣性，具有明顯的殺傷潛力

3. TEG行為的轉(zhuǎn)錄組分析

對與BC PDO共培養(yǎng)后包含不同行為特征的TEG群體進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，包括一個含有超級參與者（>90%）的TEG群體（圖 3a和3b）。與類器官共培養(yǎng)6?h后，觀察到效應(yīng)CD8+ (CD8+eff)、效應(yīng)CD4+ (CD4+eff)和記憶CD4+ (CD4+mem)具有顯著的轉(zhuǎn)錄變化（圖 3c-e）。本研究開發(fā)了一種從已測序的TEG群體（圖 3f）的軌跡分析推斷行為概率映射方法，用于檢測受環(huán)境刺激、短時間PDO參與和長時間PDO參與調(diào)節(jié)的TEG中的基因編號（圖3f，g）。

在CD8+eff、CD4+eff和CD4+mem TEG之間動態(tài)轉(zhuǎn)錄高度保守（圖 3g），包括通過環(huán)境刺激或PDO參與導(dǎo)致的下調(diào)（CL1）或上調(diào)（CL3）的基因，以及沿著軌跡分析瞬時表達的基因（CL2）。這種差異動態(tài)表達與已知基因功能相匹配，證實了TEG的穩(wěn)定性，如與CD3信號復(fù)合物相關(guān)的基因（LCK、SOS1、CD3E、CD3G、CL1）在T細胞激活后下調(diào)（圖 3h）。在CL3中發(fā)現(xiàn)了對腫瘤調(diào)控至關(guān)重要的NF-kB信號以及效應(yīng)分子FASLG、IFNG、GZMB和TNF，環(huán)境刺激誘導(dǎo)的NF-kB信號在長時間PDO參與后達到最大表達水平，而效應(yīng)分子在PDO一參與就表達（圖 3i）。此外，CL3含有與核糖體RNA加工相關(guān)的基因，這些基因僅在與類器官長時間接觸后才會增加（圖 3h）。CL2包含早期激活標志物CD69和EGR1，在與類器官短暫的接觸后具有峰值表達，在軌跡分析末端上調(diào)（圖 3i)。因此，本研究確定了TEG在腫瘤靶向過程中的動態(tài)基因編程。

在那些以TEG子集特異性方式調(diào)節(jié)的基因組中（CL4-8，15%的基因），CL7包含主要在類器官長時間參與后誘導(dǎo)的基因，包括細胞毒性基因（例如，PRF1、CRTAM、XCL1；圖 3h）。這組基因在CD8+eff中被特異性誘導(dǎo)，在CD4+eff TEG中被較小程度的誘導(dǎo)，但在CD4+mem TEG中幾乎不存在（圖 3j）。進一步鑒定了20個與T細胞活化和細胞毒性相關(guān)的基因和14個與其他T?細胞功能相關(guān)的基因（圖 3k）。然而，我們發(fā)現(xiàn)其中27?先前未用于描述T?細胞功能的基因（圖 3k）。因此，BEHAV3D的行為轉(zhuǎn)錄組學(xué)模塊確定了在TEG中誘導(dǎo)的特定基因的特征。

圖3 PDO暴露、參與和殺傷后TEG行為轉(zhuǎn)錄組分析

可參考的相關(guān)文獻：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01397-w