研究結果

1. COVID-19發(fā)展階段患者血清的非靶向代謝組學分析

通過與輕癥患者相比，發(fā)現(xiàn)重癥患者淋巴細胞明顯抑制，白細胞和AST升高，提示免疫系統(tǒng)和肝功能紊亂。（AST即天冬氨酸氨基轉移酶，它在血液中水平較低,當身體組織或器官患病或受損時，細胞會產(chǎn)生AST并釋放到血液中去；可用于評估肝臟損傷情況）。

非靶向代謝組學分析中，發(fā)現(xiàn)隊列中的樣品共鑒定出2466個代謝物峰，負離子模式631個、正離子模式下的1835個；通過篩選，鑒定出240種代謝物。輕癥組的代謝物與正常組部分重合，而重癥組和恢復組很容易區(qū)分(圖1B)。240個代謝物中有193個與COVID-19顯著相關(圖1C)?；鹕綀D顯示了不同組代謝物與正常組相比上調下調的情況(圖1D)；與正常組對比，顯著上調的代謝物：輕癥組有48個，嚴重組有59個，恢復組有64個；顯著下調的代謝物：輕癥組有33個，重癥組有29個，恢復組有34個。在重要的代謝物中，谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鳥氨酸、犬嘌呤、色氨酸等多種氨基酸與疾病的嚴重程度相關；參與TCA循環(huán)的葡萄糖、乳酸、丙酮酸等代謝物隨著COVID-19的進展表現(xiàn)出紊亂。

結果表明，在COVID-19進展過程中，參與氮代謝、TCA循環(huán)、脂肪酸代謝等途徑的代謝產(chǎn)物是不平衡的。

圖1 | 發(fā)現(xiàn)隊列所有COVID-19發(fā)展階段患者血清的非靶向代謝組學分析。

（B）四組非靶向代謝組學的主成分分析（PCA）。

（C）193種代謝物熱圖?（FDR<0.05，F(xiàn)DR的含義是錯誤拒絕(拒絕真的(原)假設)的個數(shù)占所有被拒絕的原假設個數(shù)的比例的期望值）。

（D）火山圖。（紅色為顯著上調，藍色為顯著下調，F(xiàn)DR<0.05,Log2(FC)>0.25或<-0.25,OPLS-DA VIP>1。）

2.靶向代謝組學揭示了COVID-19患者的代謝物變化趨勢

使用靶向代謝組學分析；首先根據(jù)發(fā)現(xiàn)隊列中59名受試者的血清代謝物(4個樣本因體積小而被排除)；定量到了199種代謝物。根據(jù)不同組的濃度，將199個代謝物分為16個簇；然后根據(jù)恢復組的代謝物是否恢復到正常水平將這些簇分為三組(圖S3)。

圖S3 | 靶向代謝組學揭示了發(fā)現(xiàn)隊列不同階段代謝物變化趨勢。

圖S3A中代謝物的濃度隨疾病發(fā)展而升高，恢復組維持在較高水平；

圖S3B中代謝物的濃度隨著疾病發(fā)展而降低，恢復組比正常水平低；

圖S3C中代謝物濃度恢復到接近正常水平。

圖S4 | 從發(fā)現(xiàn)隊列中獲得的血清進行靶向代謝組學分析。

（A）火山圖（突出了與正常組相比，輕度組、重度組和恢復組受試者的代謝物差異）。

（B）輕度組、重度組、恢復組與正常組比較的OPLS-DA評分圖。

（C）用于評價OPLS-DA模型質量的排列檢驗。

將COVID-19不同階段與健康組的代謝組學圖譜進行了比較，以確定和描述涉及COVID-19進展的特定代謝物和代謝途徑。重點研究了COVID-19不同階段與正常組之間的差異。OPLS-DA模型的Q2和R2一般采用0.5的顯著性閾值。以下各組差異明顯：正常組與輕度組，R2Y=0.941、Q2Y=0.783；正常與嚴重，R2Y=0.955、 Q2Y=0.79；正常組與恢復組，R2Y=0.926、 Q2Y=0.815(圖S4)。此外，我們定量了另外118名受試者的血清代謝物作為獨立驗證。采用相同的模型，結果一致性高(圖S5)。

圖S5 | 從驗證隊列中獲得的血清進行靶向代謝組學分析。

（A）火山圖（突出了與正常組相比，輕度組、重度組和恢復組受試者的代謝物差異）。

（B）輕度組、重度組、恢復組與正常組比較的OPLS-DA評分圖。

（C）用于評價OPLS-DA模型質量的排列檢驗。

3.不同階段主要代謝物及通路變化

與正常組相比，在靶向代謝組學測定的199個代謝物中，有80個在至少一個階段顯示出顯著差異(FDR<0.05)(圖2A)。SMPDB和KEGG通路分析顯示天冬氨酸代謝、尿素循環(huán)、精氨酸和脯氨酸代謝、甘氨酸和絲氨酸代謝、TCA循環(huán)失調(圖2B)。特別是精氨酸和鳥氨酸出現(xiàn)了明顯的下降或增加(圖2-b，圖6)，這兩種成分都是尿素循環(huán)中的關鍵成分。

三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝和糖酵解的改變共同表明了能量代謝紊亂，重癥組極高的乳酸水平支持了這一結論。這可能是因為即使有呼吸支持，患者仍無法有效獲取氧氣，從而對能量代謝造成巨大障礙。這一現(xiàn)象也在經(jīng)歷重癥進入恢復組的患者中發(fā)現(xiàn)，表明即使新冠病毒被完全清除，損害仍然存在一段時間或很長時間(圖2B)。

圖2 |?發(fā)現(xiàn)隊列不同階段血清主要代謝物的變化。

（A）靶向代謝組學定量的代謝物熱圖。

（B）通路分析表明了氨基酸代謝的顯著差異（路徑中的每個框代表1個代謝物，如果在靶向代謝組學中發(fā)現(xiàn)，則用紅色標記，如果在非靶向代謝組學中發(fā)現(xiàn)，則用黃色標記。條形圖顯示正常、輕度、重度、恢復期代謝產(chǎn)物的平均絕對濃度(從左至右)。綠色代表有機酸；橙色代表氨基酸；紫色表示碳水化合物，藍色表示短鏈脂肪酸）。

4.COVID-19發(fā)展中尿素循環(huán)和TCA循環(huán)失調

負責氨基酸代謝的尿素循環(huán)和負責能量代謝的TCA循環(huán)為最受影響的代謝通路(圖3)。在發(fā)現(xiàn)隊列中，11種代謝物(屬于或是與這兩個通路密切相關)，在不同組間具有顯著變化(圖3)。在驗證隊列中，11種代謝物中有9種在不同組間有顯著變化(圖3)。這9種代謝物是肌酸、精氨酸、鳥氨酸、天冬氨酸、丙酮酸、蘋果酸、瓜氨酸、谷氨酰胺和2-酮戊二酸。

與正常組相比，2-酮戊二酸、天冬氨酸和鳥氨酸水平顯著增加；蘋果酸和2-酮戊二酸在重度組中含量最高，提示TCA周期受到嚴重影響；在尿素循環(huán)中起關鍵作用的鳥氨酸持續(xù)增加，在恢復組達到最高水平；與正常組相比，重癥組尿素循環(huán)中另一重要氨基酸精氨酸水平明顯下降，提示新冠肺炎進展過程中尿素循環(huán)失調。

圖3 | 尿素循環(huán)和TCA循環(huán)的失調可能參與了病理進展。

箱線圖顯示了不同階段發(fā)現(xiàn)和驗證隊列的樣本中這些代謝物的水平。發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列的代謝組學路徑分析均發(fā)現(xiàn)，尿素循環(huán)和TCA循環(huán)是影響COVID-19患者的兩種主要途徑。星號表示差異有統(tǒng)計學意義，p值：*，<0.05；**，<0.01；**，*<0.001。箱形圖中的顏色代表不同的階段:藍色代表正常;橙色代表溫和;紅色代表嚴重；黃色代表恢復。

5.血清代謝物組合可能是潛在的預測生物標志物

為了研究這9種代謝物是否可以作為COVID-19患者風險分層的生物標志物，使用發(fā)現(xiàn)隊列訓練了幾個經(jīng)典模型(包括決策樹、隨機森林、支持向量機、以及邏輯回歸)，并使用驗證隊列進行了驗證；其中邏輯回歸模型表現(xiàn)較好。使用上述9種代謝物的不同組合和整個研究參與者的數(shù)據(jù)(發(fā)現(xiàn)隊列+驗證隊列)，發(fā)現(xiàn)代謝物越多，任何兩組之間的所有區(qū)別觀察到的分類值越高(圖4A-F)。

然而，在疾病進展過程中循環(huán)代謝物的改變模式是不同的。例如，當使用較少的代謝物時，該模型可以區(qū)分嚴重和正常，準確率相對較高，但不能區(qū)分輕度和正常(圖4-G)。隨著代謝物數(shù)量的增加，該模型區(qū)分輕度和重度的準確性有所提高(圖4G-I)。此外，相對較高的AUC值來區(qū)分恢復和正常，也表明在嚴重情況下幸存的受試者可能仍然遭受與代謝條件有關的長期附帶損害。

為了更好地驗證發(fā)現(xiàn)，將這9種代謝物與Shen 等人的結果進行了比較，發(fā)現(xiàn)有4種代謝物存在重疊：蘋果酸、丙酮酸、瓜氨酸和谷氨酰胺。然后我們用這4種代謝物作為特征建立邏輯回歸模型，并使用發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列進行訓練。然后利用Shen等人論文數(shù)據(jù)發(fā)表的結果對該模型進行了驗證，在區(qū)分嚴重和正常方面取得了良好的效果(圖S13)，證明該模型在各個研究中都是成立的。上述結果提示，蘋果酸、丙酮酸、瓜氨酸和谷氨酰胺可能作為COVID-19重癥患者危險分層的潛在生物標志物。

圖4 | 尿素循環(huán)和TCA循環(huán)中9種顯著改變的代謝物組合模型的AUC。

（A-F）使用1—9種代謝物區(qū)分不同階段的AUC散點圖。（x軸顯示模型中使用的代謝物的數(shù)量；建立所有可能組合的模型，每個點表示單個組合的AUC。）

（G-I）使用3、5和7種代謝物的模型的平均AUC圖。

圖S13 | 使用Shen等的數(shù)據(jù)驗證邏輯回歸模型的AUC

6.COVID-19發(fā)展過程中的三種細胞因子

病毒防御降低與大量炎癥細胞因子的產(chǎn)生是COVID-19的特征。為了顯示隊列中炎癥標志物的變化，從每組中選取了18個容量充足的樣本，檢測了IL-6、TNF-α和IL-1β水平，這3個指標均與COVID-19感染有關。

與對照相比，IL-1β水平在重癥組最高，恢復組低很多，但仍高于對照組(圖S14-A)。IL-6和TNF-α的趨勢相同(圖S14-B和圖S14-C)。這些結果提示，炎癥水平與COVID-19疾病的發(fā)展密切相關，可能與代謝物的產(chǎn)生有關。因此，進一步進行相關分析，相關性分析發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、肌酸、蘋果酸和2-酮戊二酸的水平與細胞因子的表達呈正相關(圖S15)。

圖S14 |?驗證隊列中不同組血清中IL-1β、TNF-α和IL-6三種因子水平的檢測。

（A）IL-1β。

（B）TNF-α。

（C）IL-6。

圖S15 |?正常組、輕度組、重度組、恢復組9種代謝物與3種細胞因子的相關性分析。

在9種代謝物中，天冬氨酸與TNF-α呈正相關，蘋果酸和肌酸與IL-6和IL-1β呈正相關。2-酮戊二酸與三種細胞因子均呈正相關。

圖7 | AC和AL對自噬介導的脂質清除的影響

相關討論

本研究首次系統(tǒng)全面地提供了COVID-19患者各階段，特別是恢復期血清代謝特征的觀點。對COVID-19患者血清的靶向和非靶向代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)了輕度、重度和恢復期循環(huán)代謝物的不同改變模式。感染新冠病毒的患者多數(shù)病情輕，部分患者病情發(fā)展為重癥或危重癥。這些重癥型和恢復型病例是由宿主對感染的反應驅動的，從而導致多系統(tǒng)功能障礙和病理。對COVID-19患者各階段循環(huán)代謝產(chǎn)物的綜合分析，有助于制定綜合策略，更好地治療該疾病。

與正常水平相比，蘋果酸、2-酮戊二酸和天冬氨酸等循環(huán)代謝物均有所升高，提示糖代謝異常和TCA循環(huán)可能對COVID-19疾病過程中的易感、嚴重程度和恢復至關重要。葡萄糖要么通過有氧代謝為多種生物過程提供能量，要么通過戊糖磷酸途徑氧化生成NADPH維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，參與宿主在有氧條件下對抗致病微生物的免疫應答。而在COVID-19患者最常見的無氧狀態(tài)下，葡萄糖經(jīng)過糖酵解和發(fā)酵生成乳酸，ATP生成量有限，導致血乳酸和LDH水平升高。

發(fā)現(xiàn)表明，除了大多數(shù)COVID-19患者通常發(fā)生的厭氧糖酵解外，TCA循環(huán)在疾病的所有階段也都增強了。提出SARS-CoV-2病毒劫持宿主機制，包括葡萄糖代謝，以促進COVID-19的發(fā)病機制。

在數(shù)據(jù)集中，與健康對照組相比，COVID-19患者血清中精氨酸水平明顯下降，這與其他團隊的研究結果一致。精氨酸既可以通過精氨酸酶轉化為鳥氨酸和尿素，也可以通過一氧化氮合酶轉化為一氧化氮和瓜氨酸。據(jù)報道，一氧化氮或其衍生物影響SARS-CoV的S蛋白與其同源受體血管緊張素轉換酶Ⅱ的融合，并在病毒復制的早期步驟中減少病毒RNA的產(chǎn)生。因此，研究SARS-COV-2感染是否通過將代謝途徑轉換為尿素循環(huán)來減少一氧化氮的生成，以保持病毒復制，這將是有趣的。

雖然在本次研究中分別成功招募了63例和118例患者作為發(fā)現(xiàn)隊列和驗證隊列，但為了獲得最好的可靠性，隊列的規(guī)模仍然相對較小。為了證實發(fā)現(xiàn)，可能需要對來自更大規(guī)模COVID-19隊列的血清樣本進行代謝分析。然而，驗證隊列和發(fā)現(xiàn)隊列的高一致性進一步鞏固了研究的結果。此外，隊列中還有一些重要的參數(shù)沒有匹配。例如，重癥病例多發(fā)生在老年人。雖然對照組、輕度組、恢復組之間沒有顯著差異，但輕度組、恢復組與重度組之間確實存在自然的不匹配，在解釋結果時應考慮到這一點。

研究結論

在這項研究中，代謝組學數(shù)據(jù)提供了COVID-19患者各階段循環(huán)代謝物特征的綜合觀點，并確定了葡萄糖代謝和尿素循環(huán)的代謝重編程是COVID-19的潛在病理機制。在新冠肺炎病程的不同階段，靶向宿主代謝可能是一種可行的方法。

參考文獻

1.Zhang X, Tan Y, Ling Y, et al.Viral and host factors related to the clinical outcome of COVID-19. Nature 2020; 583: 437–440.

2.Tianbing W, Yanqiu W, Johnson L, et al.A four-compartment model for the COVID-19 infection—implications on infection kinetics, control measures, and lockdown exit strategies. Precis Clin Med 2020; 3: 104–112.

3.Chan JF, Yuan S, Kok KH, et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet 2020; 395: 514–523.

4.Murthy S, Gomersall CD, Fowler RA. Care for critically Ill patients with COVID-19. JAMA 2020; 323: 1499–1500.?

5.Wu Z, McGoogan JM. Characteristics of and important lessons from the coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak in china: summary of a report of 72?314 cases from the Chinese Center for Disease Control and Prevention. JAMA 2020; 323: 1239–1242.?

小鹿推薦

本研究首先使用非靶向代謝組學方法來分析COVID-19患者的代謝變化，然后用靶向代謝組學方法進行確認。從而提供了COVID-19患者各階段循環(huán)代謝物的特征，發(fā)現(xiàn)負責氨基酸代謝的尿素循環(huán)和負責能量代謝的TCA循環(huán)為最受影響的代謝通路，確定了COVID-19的潛在病理機制；此外，進一步的分析也為COVID-19患者風險分層提供了思路。

文末看點｜lumingbio

上海鹿明生物科技有限公司多年來，一直專注于生命科學和生命技術領域，是國內早期開展以蛋白組學和代謝組學為基礎的多層組學整合實驗與分析的團隊。目前在多層組學研究已經(jīng)有了成熟的技術方法，歡迎各位老師前來咨詢哦~

同時，鹿明生物B站上線了5大頻道板塊，分別在空間代謝組學、生信分析、多層組學、代謝組學方向為各位科研老師提供有效的方法工具和思路~其中，生信板塊也擁有著觀看量1.5萬的生信爆款視頻~歡迎各位老師訪問

歡迎百度搜索鹿明生物——訪問鹿明生物官網(wǎng)——了解代謝組學技術

猜你還想看

·有機酸專題 | IF:60.716 有機酸靶向代謝組學在腫瘤細胞轉移中的研究

·食品微生物專題 | 2篇！多組學技術搭配如何進行食品領域方案設計？

·項目文章 | 轉錄組學+蛋白組學為改善肝葡萄糖脂代謝機制提供了新見解

·2張漫畫+一張導圖絕妙詮釋六款有機酸研究摘要

END本文系鹿明生物原創(chuàng)