今天給同學(xué)們分享一篇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激+預(yù)后模型的生信文章“A novel defined risk signature of endoplasmic reticulum stress-related genes for predicting the prognosis and immune infiltration status of ovarian cancer”，這篇文章于2023年1月15日發(fā)表在J Zhejiang Univ Sci B期刊上，影響因子為5.1。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激作為癌癥的新興標(biāo)志特征，對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和化療抵抗具有重要影響。卵巢癌（OvCa）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，因為該病在診斷時通常已處于晚期。近年來，研究探討了ER應(yīng)激對OvCa的影響，但ER應(yīng)激相關(guān)基因在OvCa預(yù)后中的預(yù)測作用尚未被探索。

1. 使用七個已確定的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因開發(fā)風(fēng)險模型

作者通過單變量Cox回歸分析從癌癥基因組圖譜（TCGA）-卵巢癌（OV）隊列（n=368）和基因表達(dá)雜志（GEO）數(shù)據(jù)集（訪問號：GSE26712；n=184）中確定了與預(yù)后相關(guān)的基因。基因數(shù)量顯示在工作流程圖中（圖1a）。經(jīng)過交集運算，篩選出了8個可能與預(yù)后相關(guān)的基因（P<0.05），分別是：瞬時受體電位陽離子通道亞家族Ⅴ成員4（TRPV4）、胰島素樣生長因子2受體（IGF2R）、Forkhead box O1（FOXO1；在GSE49997數(shù)據(jù)集中缺失）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1（RB1）基因、熱休克蛋白（HSP）家族A（HSP70）成員2（HSPA2）、鳥嘌呤（PXN）、轉(zhuǎn)運蛋白1三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合盒亞家族B成員（TAP1）和ATP酶肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca 2+ 轉(zhuǎn)運3（ATP2A3）。然后，作者進(jìn)行了最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸分析，從這8個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因中選擇出最可靠的預(yù)后基因。最終，根據(jù)最小標(biāo)準(zhǔn)決定的最佳λ值，保留了其中7個基因及其系數(shù)（圖C中）。在這些基因中，ATP2A3和TAP1是卵巢癌存活的保護(hù)因子，風(fēng)險比（HR）小于1；而FOXO1、HSPA2、RB1、TRPV4和IGF2R是風(fēng)險因子，風(fēng)險比大于1（圖1d）?；谶@七個基因的表達(dá)譜構(gòu)建了一個相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，以確定它們之間的關(guān)系（圖1e）。

圖1 發(fā)展風(fēng)險標(biāo)識的預(yù)后基因鑒定

2. 在TCGA-OV隊列中開發(fā)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)志

鑒于樣本數(shù)量充足的特權(quán)，TCGA-OV隊列被指定用于構(gòu)建風(fēng)險基因特征。根據(jù)中位數(shù)風(fēng)險評分，184名患者被歸類為低風(fēng)險組，而其余184名患者被歸類為高風(fēng)險組（圖2a）。進(jìn)行了主成分分析（PCA）和t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）分析，以將這些簇中的患者分配到相應(yīng)的組別中?；颊叩恼w生存（OS）相關(guān)預(yù)測模型分布如圖2b所示，表明高風(fēng)險組的患者死亡可能性更高，生存時間更短。兩組之間每個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯不同（圖2c）。Kaplan-Meier（K-M）曲線顯示低風(fēng)險組的患者具有比高風(fēng)險組更有利的生存結(jié)果（P<0.0001；圖2d）。進(jìn)行了時間相關(guān)的受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析，評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)志對生存期的預(yù)測作用。如圖2e所示，曲線下面積（AUC）在一年內(nèi)為0.689，在兩年內(nèi)為0.657，在三年內(nèi)為0.619。七個單基因的K-M曲線進(jìn)一步驗證了該標(biāo)志在TCGA-OV隊列中的預(yù)測價值。

圖2 在TCGA隊列中對OvCa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)記進(jìn)行訓(xùn)練

3. TCGA-OV隊列中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)志的獨立預(yù)后價值

隨后，對TCGA-OV訓(xùn)練隊列進(jìn)行了單變量和多變量Cox分析，以探索風(fēng)險評分是否可以作為獨立的風(fēng)險因素。如圖3a、3b所示。ER應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)記與OvCa患者的OS顯著相關(guān)（HR，2.99；95%置信區(qū)間（CI），2.08-4.29；P<0.001；參見多元Cox分析），表明TCGA-OV隊列構(gòu)建的ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)記是OvCa患者的獨立預(yù)后因子。多指標(biāo)ROC曲線（圖3c）顯示了風(fēng)險標(biāo)記和臨床特征的預(yù)測價值，表明ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險模型在年齡、分級和分期方面的預(yù)測準(zhǔn)確性優(yōu)于其他因素。

圖3 TCGA隊列中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)志的獨立預(yù)后價值

此外，作者制作了一個綜合考慮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激風(fēng)險標(biāo)志、分級、年齡和階段的圖表，用于預(yù)測TCGA-OV隊列中1年、3年和5年的生存率（圖3d）。在這個圖表中，每個項目根據(jù)其對生存率的風(fēng)險貢獻(xiàn)被分配了相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。校準(zhǔn)曲線用于對圖表進(jìn)行內(nèi)部驗證（圖3e）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)志可以作為TCGA-OV隊列中的獨立風(fēng)險因素。

4. 在ICGC和GEO隊列中驗證與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)志

ICGC和GEO數(shù)據(jù)集（存取編號：GSE49997）共有117個案例被視為外部驗證集。從表達(dá)譜陣列中提取了七個或六個（GSE49997中缺少FOXO1）與生存相關(guān)的基因。使用與TCGA-OV隊列相同的公式計算了兩個驗證集中每個樣本的風(fēng)險評分。利用PCA和t-SNE分析，根據(jù)風(fēng)險基因集可視化不同人群之間的風(fēng)險分布。

圖4a和4b分別顯示了ICGC和GEO數(shù)據(jù)集中人群的OS相關(guān)風(fēng)險模型分布。代表與ER應(yīng)激相關(guān)的每個風(fēng)險特征的表達(dá)水平的熱圖顯示了驗證集中低風(fēng)險和高風(fēng)險人群之間的變化趨勢（圖4c和4d）。有趣的是，作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在兩個驗證集中，高風(fēng)險組的生存可能性都顯著低于低風(fēng)險組（ICGC隊列中P=0.0032，GSE49997隊列中P=0.04；圖4e和4f）。然后，繪制與時間相關(guān)的ROC曲線，以評估驗證集中ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險特征的預(yù)測價值。如圖所示。圖4g和4h 在ICGC隊列中，2年和3年的AUC分別為0.623和0.673，在GSE49997隊列中，1年、兩年和3年分別為0.654和0.612，這表明作者的模型在驗證隊列中具有強大的預(yù)測作用。再次應(yīng)用單變量和多變量Cox分析的森林圖，以確定作者的風(fēng)險模型的獨立預(yù)后作用。還構(gòu)建了ER應(yīng)激風(fēng)險特征和可獲得的臨床參數(shù)整合的諾模圖，以預(yù)測兩個驗證隊列中的OS。校準(zhǔn)曲線用于列線圖的內(nèi)部驗證。在兩個外部隊列中測試的上述數(shù)據(jù)證明了該風(fēng)險模型的穩(wěn)健性。

圖4 在ICGC和GEO隊列中驗證與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險標(biāo)記

5. 風(fēng)險標(biāo)識與經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的相關(guān)性及其功能注釋

之前已經(jīng)確定了三條經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，可能通過不同的方向決定細(xì)胞命運。通過分析作者的風(fēng)險標(biāo)志與這些經(jīng)典內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的中心基因之間的相關(guān)性，以確定不同卵巢癌組中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。在高風(fēng)險組中，IRE1α和PERK的水平高于低風(fēng)險組，盡管在GSE49997數(shù)據(jù)集中的統(tǒng)計顯著性較小。有趣的是，低風(fēng)險組中的促凋亡途徑（ATF4和CHOP）上調(diào)，證明了作者標(biāo)志的與細(xì)胞命運相關(guān)的作用（圖5a-5c）。為了評估這些與預(yù)后相關(guān)的基因的功能，進(jìn)行了基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）途徑分析。GO的前五個富集術(shù)語如圖5d所示，KEGG的前四個富集術(shù)語如圖5e所示。進(jìn)一步采用基因集富集分析（GSEA）方法來補充這些基因的功能注釋。結(jié)果表明，這些基因在多個細(xì)胞因子相互作用和免疫相關(guān)術(shù)語中富集。

圖5 ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)志物的功能富集

6. ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)志的免疫浸潤特征

TAP1的表達(dá)水平與CD8呈正相關(guān)，這可能意味著抗腫瘤成分的浸潤狀態(tài)?？傊?，這些結(jié)果支持了ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險特征可能通過與OvCa中的免疫微環(huán)境相互作用來影響疾病進(jìn)展的假設(shè)。

圖6 ER應(yīng)激相關(guān)風(fēng)險標(biāo)志的免疫浸潤特征

總結(jié)

總之，作者的工作確定了ER應(yīng)激相關(guān)的風(fēng)險特征，為OvCa預(yù)后預(yù)測提供了新的注釋。雙重驗證證明了該標(biāo)志的穩(wěn)健性。此外，已證實經(jīng)典ER應(yīng)激途徑的優(yōu)先臂參與了低風(fēng)險和高風(fēng)險人群。對OvCa中ER應(yīng)激相關(guān)基因的富集和免疫浸潤譜的分析為未來研究其與抗腫瘤免疫之間的機制提供了重要的發(fā)現(xiàn)。