? ? ? ?THP-1細(xì)胞系是一種人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，來自一位急性單核細(xì)胞白血病患者的外周血液，于1980年被建系，屬于懸浮細(xì)胞。相對于U937、HL-60、ML-2等白血病細(xì)胞系，THP-1更有類似人原代單核細(xì)胞的形態(tài)和功能特征（包括細(xì)胞分化標(biāo)記）；而相對于人外周血單核細(xì)胞（PBMC），THP-1更易在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)和擴(kuò)增，且具有更穩(wěn)定的基因背景，可用于轉(zhuǎn)染或感染實(shí)驗(yàn)，利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)。因此，THP-1是各大實(shí)驗(yàn)室常用的急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，通過構(gòu)建THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可用于研究免疫和炎癥的作用機(jī)制。

? ? ? ?接下來向大家介紹THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在炎癥及免疫研究中的應(yīng)用！?

【THP-1巨噬細(xì)胞炎癥研究】?

? ? ? ?黃芪多糖(APS)具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)n6 -甲基腺苷(m6A)在炎癥發(fā)生中的表觀遺傳調(diào)控作用。然而，APS對m6A的影響尚不清楚。WTAP是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的必需蛋白之一，在m6A的轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。本研究通過在THP-1細(xì)胞中過表達(dá)WTAP，探討了m6A蛋白在APS調(diào)節(jié)THP-1巨噬細(xì)胞炎癥中的作用機(jī)制[1]。

? ? ? ?為了研究黃芪多糖調(diào)節(jié)m6A修飾水平的機(jī)制，作者首先檢測了黃芪多糖處理是否會(huì)影響脂多糖(Lps)誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞中m6A修飾系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)。如圖1所示，APS處理24 h后，WTAP的mRNA表達(dá)明顯降低，與其他相關(guān)蛋白相比，WTAP蛋白水平也明顯降低，表明APS可以通過調(diào)節(jié)WTAP表達(dá)來影響m6A修飾水平。

? ? ? ?為了驗(yàn)證APS是否通過WTAP影響IL-6的表達(dá)，作者分別用qRT-PCR和WB檢測了WTAP過表達(dá)后IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)。WTAP過表達(dá)改善了APS處理的THP-1巨噬細(xì)胞中IL-6的低表達(dá)(圖2)。

? ? ? ?作者假設(shè)WTAP通過NF-KB途徑調(diào)控IL-6，并通過WB檢測APS處理的THP-1巨噬細(xì)胞中p65的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，APS不影響p65的表達(dá)(圖3)。WTAP過表達(dá)不影響THP-1巨噬細(xì)胞中p65的總體表達(dá)水平。APS可阻止LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的易位。然而，在APS處理的THP-1巨噬細(xì)胞中，WTAP過表達(dá)促進(jìn)了p65從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的易位。為了更好地研究p65的核和細(xì)胞質(zhì)分布，從THP-1巨噬細(xì)胞中提取核和細(xì)胞質(zhì)蛋白。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染WTAP過表達(dá)質(zhì)粒的THP-1巨噬細(xì)胞中，APS介導(dǎo)的p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，APS通過WTAP介導(dǎo)的p65核易位調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)。

? ? ? ?綜上所述，作者通過在THP-1細(xì)胞中過表達(dá)WTAP，研究了WTAP通過調(diào)節(jié)THP-1巨噬細(xì)胞中m6A修飾水平介導(dǎo)APS的抗炎作用，揭示了APS在表觀遺傳水平調(diào)控炎癥的新機(jī)制。

【THP-1巨噬細(xì)胞免疫研究】?

? ? ? ?苯二氮卓類藥物廣泛用于麻醉和鎮(zhèn)靜，并具有免疫調(diào)節(jié)特性，但其中涉及的細(xì)胞靶點(diǎn)和中間信號(hào)通路尚不清楚。因此，作者研究了苯二氮卓類藥物咪達(dá)唑侖對人巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)的分子機(jī)制[2]。

? ? ? ?作者先是探究了咪達(dá)唑侖是否可以通過LPS影響巨噬細(xì)胞的激活。通過熒光激活細(xì)胞分選確定LPS刺激THP-1可上調(diào)共刺激CD80的表達(dá)，并增加IL-6、TNF-α、IL-10和NO產(chǎn)物(硝酸鹽和亞硝酸鹽)的培養(yǎng)基濃度(圖4)，而咪達(dá)唑侖預(yù)處理可顯著抑制CD80的上調(diào)以及IL-6、TNF-α、IL-10和硝酸鹽/亞硝酸鹽的培養(yǎng)基濃度。此外，咪達(dá)唑侖對LPS誘導(dǎo)的促炎分子上調(diào)的抑制作用隨著咪達(dá)唑侖劑量的增加而增強(qiáng)。

? ? ? ?作者在LPS刺激前用各種TSPO配體(Ro5-4864、etifoxine和FGIN1-27)和GABAA受體配體(vigabatrin和muscimol)預(yù)處理THP-1細(xì)胞和PMDMs，研究TSPO受體是否有助于咪達(dá)唑倫對巨噬細(xì)胞活化的抑制作用。結(jié)果顯示TSPO配體抑制LPS誘導(dǎo)的CD80上調(diào)和LPS增強(qiáng)的IL-6釋放。相反，GABAA受體配體既不抑制LPS誘導(dǎo)的CD80上調(diào)，也不抑制IL-6釋放。TSPO配體降低了LPS誘導(dǎo)的THP-1 Xblue CD14細(xì)胞中NF-kB/AP-1的激活。這些結(jié)果表明咪達(dá)唑侖通過激活TSPO信號(hào)傳導(dǎo)降低促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而阻斷NF-kB/AP-1對相關(guān)促炎基因的反激活。

? ? ? ?為了進(jìn)一步研究咪達(dá)唑侖對LPS處理的THP-1細(xì)胞的抑制作用是否依賴于TSPO信號(hào)，作者構(gòu)建了TSPO過表達(dá)的THP-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，比較咪達(dá)唑侖對WT型過表達(dá)的THP-1細(xì)胞的劑量(圖4 )。過表達(dá)TSPO抑制了CD80和IL-6的基礎(chǔ)表達(dá)，且咪達(dá)唑侖對LPS誘導(dǎo)的CD80和IL-6上調(diào)的抑制作用增強(qiáng)(即咪達(dá)唑侖敏感性更高)。

? ? ? ?作者觀察了咪達(dá)唑侖對THP-1細(xì)胞NF-KB、i -KBα蛋白及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性的影響。通過過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TSPO)證實(shí)了TSPO配體參與咪達(dá)唑侖免疫調(diào)節(jié)作用，證明咪達(dá)唑侖通過激活TSPO信號(hào)通路抑制LPS刺激的人巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞活性的抑制可能導(dǎo)致苯二氮卓類藥物在危重患者中產(chǎn)生有害副作用。

? ? ? ? 想了解過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的更多應(yīng)用的話，歡迎找小源交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]?Long H, Lin H, Zheng P, et al. WTAP mediates the anti-inflammatory effect of Astragalus mongholicus polysaccharide on THP-1 macrophages[J]. Frontiers in Pharmacology, 2022, 13: 1023878.

[2]?Horiguchi Y, Ohta N, Yamamoto S, et al. Midazolam suppresses the lipopolysaccharide-stimulated immune responses of human macrophages via translocator protein signaling[J]. International immunopharmacology, 2019, 66: 373-382.