棉花是世界上天然纖維的主要來源。近年來，氣候變化給植物帶來的干旱、高鹽等滲透脅迫，使棉花產(chǎn)量穩(wěn)步下降。為適應(yīng)變化莫測的氣候，植物不斷進化出復(fù)雜而有組織的應(yīng)對非生物脅迫的反應(yīng)機制，其中數(shù)千個抗性相關(guān)基因間的相互作用，在提高植物的抗旱性和耐鹽性中發(fā)揮著重要作用。功能基因組學(xué)研究表明，植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）就是這樣一種基因，它在植物發(fā)育過程中，面對多種環(huán)境脅迫時均有表達(dá)，對提高植物的抗旱性和耐鹽性具有重要作用。

2022年3月，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所在International Journal of Biological Macromolecules上發(fā)表了題為“Late embryogenesis abundant gene LEA3 (Gh_A08G0694) enhances drought?and salt stress tolerance in cotton”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)LEA3能夠增強棉花的抗旱性和耐鹽性。該項目中所用的棉花酵母文庫由歐易生物構(gòu)建。

本研究首先對不同物種間的LEA3蛋白進行了系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果顯示LEA3蛋白分為7個不同的分支，且發(fā)現(xiàn)了四倍體、二倍體棉花和其他植物中LEA3蛋白的進化關(guān)系。此外，本研究對LEA3家族的基因結(jié)構(gòu)、序列重復(fù)、啟動子上的順式調(diào)控元件功能以及染色體定位等均進行了詳細(xì)的分析。其中GO分析結(jié)果顯示GO: 0006950（響應(yīng)刺激和非生物脅迫的生物過程）是GhLEA3的唯一GO term（圖1）。

圖1 | ?LEA3基因在染色體中的分布、基因結(jié)構(gòu)和GO分析

本研究以MG-85陸地棉為實驗材料，采用種子水培至三葉期開始進行鹽和干旱脅迫處理，并于脅迫后的0-12h和24-48h內(nèi)，每間隔3h進行樣品采集。RT-PCR檢測到，在0-48 h的干旱和鹽脅迫下，棉花GhLEA3基因在不同組織中的表達(dá)量顯著增加，尤其是在根和葉中（圖2）。

圖2 | GhLEA3在干旱和鹽脅迫條件下的表達(dá)分析

亞細(xì)胞定位實驗顯示，GhLEA3定位在細(xì)胞葉綠體。功能驗證實驗發(fā)現(xiàn)，GhLEA3敲除后，棉株對干旱和高鹽脅迫的敏感性增強。表現(xiàn)為在干旱和鹽脅條件下，GhLEA3敲除后棉株與野生型棉株相比，在形態(tài)、生理和分子指標(biāo)上均出現(xiàn)顯著變化，如莖/根鮮重降低，葉綠素含量降低，葉片相對含水量降低，離子滲漏增加；POD含量下降，MDA含量上升等；脅迫相應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量下降。這說明GhLEA3 (Gh_A08G0694)基因敲除棉株對干旱和高鹽脅迫的敏感性增強。值得注意的是，GhLEA3基因敲除棉株，在自然條件下與野生型無顯著生長差異（圖3）。

圖3 | GhLEA3 敲除棉株在干旱、鹽脅迫條件下的生理、生化及相關(guān)基因表達(dá)分析

同時，在擬南芥中過表達(dá)GhLEA3 (Gh_A08G0694)，結(jié)果顯示Gh_A08G0694基因的過表達(dá)增強了植株對干旱和鹽脅迫的抗性。具體方法為，首先通過RT-qPCR表達(dá)分析，從T2代中篩選出GhLEA3表達(dá)量最高的T3純合子代進行脅迫實驗，然后通過觀察及檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系在形態(tài)、生理和分子指標(biāo)上表現(xiàn)均優(yōu)于野生型對照組（圖4）。

圖4 | ?GhLEA3 過表達(dá)植株在干旱、鹽脅迫條件下的生理、生化及相關(guān)基因表達(dá)分析

為進一步了解LEA3蛋白在干旱脅迫下調(diào)控植物生長和增強抗旱性的分子機制，本研究以干旱脅迫條件下的棉花根莖葉為材料，構(gòu)建了棉花干旱脅迫酵母文庫。并以GhLEA3為誘餌，采用酵母雙雜交篩選實驗，從棉花酵母文庫中篩選獲得了GhLEA3互作蛋白，并對互作蛋白進行了GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其中的互作蛋白GhVDAC1主要參與鈣信號通路和cGMP-PKG信號通路，互作蛋白GhGAPA參與多種生物途徑，如糖原生成和代謝途徑。此外，GhVDAC1和GhGAPA受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)顯著，且在GhLEA3敲除的棉株中表達(dá)量低于野生型棉株（圖5）。

圖5 | GhLEA3互作蛋白及表達(dá)量分析

總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)Gh_A08G0694基因?qū)儆贚EA3家族，通過與VDAC1、GAPA的相互作用，可以幫助植物進行脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高線粒體的穩(wěn)定性，增強植物的非生物脅迫耐受性，在提高棉花耐鹽抗旱性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，本研究為進一步認(rèn)識和理解棉花耐鹽抗旱性的遺傳和分子機制提供了重要依據(jù)。

歡迎百度搜索歐易生物——訪問歐易生物官網(wǎng)——了解酵母文庫技術(shù)

猜你想看

1、項目文章 | Mol Plant: 中國水稻研究所寇艷君研究員團隊發(fā)現(xiàn)溫度影響稻瘟病發(fā)生的機制

2、項目文章 | 2bRAD-M微生物組幼兒園首次種水平研究，寶潔到底發(fā)現(xiàn)了什么？

3、項目文章 | 歐易單細(xì)胞測序助力解析玉米根尖單細(xì)胞圖譜，鑒定細(xì)胞類型特異性硝酸鹽響應(yīng)基因

4、項目文章 | CTM: 腫瘤細(xì)胞通過 RB1CC1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄重編程對鐵死亡敏感

End本文系歐易生物原創(chuàng)