背景介紹

熒光素酶(luciferase, Luc)是生物體內(nèi)催化熒光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）氧化發(fā)光的一類酶的統(tǒng)稱，來自于自然界能夠發(fā)光的生物。熒光素酶在基因表達(dá)研究中的應(yīng)用主要是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù),將熒光素酶基因插到預(yù)期分析的細(xì)胞染色體內(nèi),通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選,培養(yǎng)出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。其發(fā)光原理為：熒光素酶與熒光素底物在氧、Mg2+存在的環(huán)境中消耗ATP發(fā)生氧化反應(yīng)，將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽茚尫拧Ｓ捎跊]有激發(fā)光的非特異性干擾, 因此信噪比高且其組織穿透能力明顯強(qiáng)于綠色熒光蛋白（GFP）。

1986年就有研究者將螢火蟲熒光素酶基因作為測(cè)定基因表達(dá)的報(bào)告基因，由于該方法十分方便快捷、靈敏度強(qiáng)、成功率高，熒光素酶基因作為報(bào)告基因得到了廣泛的應(yīng)用，包括啟動(dòng)子活性研究、轉(zhuǎn)錄因子研究、哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交試驗(yàn)、以及活體動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)等方面，對(duì)許多科研領(lǐng)域都產(chǎn)生了重要的影響。源井生物也能向科研人員提供Luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，除了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因外，源井生物的Luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株還具有特異性強(qiáng)且高度靈敏、成像質(zhì)量高、發(fā)光強(qiáng)度可精確定量等優(yōu)點(diǎn)，可以讓研究人員十分精準(zhǔn)地跟蹤自己的細(xì)胞。

具體應(yīng)用

1.應(yīng)用于活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像實(shí)驗(yàn)[1]

例如：表達(dá)生物素酶的生物發(fā)光成像技術(shù)是研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像的主要方法。通過活體成像技術(shù)可快速準(zhǔn)確的篩選、鑒定陽性細(xì)胞株。陽性細(xì)胞克隆數(shù)量增多，發(fā)光量增強(qiáng)，進(jìn)而探討陽性細(xì)胞數(shù)與生物發(fā)光成像系統(tǒng)光通量之間的關(guān)系。采用分子克隆方法構(gòu)建pMX-Luc2質(zhì)粒，將其與pMD.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T gag-pol細(xì)胞，獲得表達(dá)Luc2的反轉(zhuǎn)錄病毒（見圖1）。將該反轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠結(jié)腸癌CT26、人小細(xì)胞肺癌NCI-H446、人結(jié)腸癌HT-29、人卵巢癌SKOV3、人肝癌SMMC-7721細(xì)胞系，建立并篩選Luc2陽性表達(dá)的細(xì)胞株(見圖2)。分別接種不同數(shù)量的細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，在4只裸鼠的不同部位（背側(cè)皮下或尾靜脈）分別接種200μl不同濃度的SKOV3-Luc2細(xì)胞。采用生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)體外、體內(nèi)接種細(xì)胞的光通量值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用表達(dá)Luc2的反轉(zhuǎn)錄病毒感染腫瘤細(xì)胞系是快速建立Luc2陽性細(xì)胞株的一種可行方法。Luc2陽性細(xì)胞數(shù)與生物發(fā)光成像系統(tǒng)中光通量值具有顯著的線性關(guān)系。

2.驗(yàn)證目的基因與候選基因的關(guān)系[2]

例如：為驗(yàn)證FN1（目的基因）與MiR-96-5P（候選基因）的關(guān)系，將包含F(xiàn)N1與miR-96-5P結(jié)合位點(diǎn)序列克隆至熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒Psi-check2中。多重比較后發(fā)現(xiàn)：與NC組相比，轉(zhuǎn)染100nM miR-96-SP inhibitor顯著上調(diào)野生型載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光素酶活性，而對(duì)于突變型載體，其熒光活性并沒有顯著變化（見圖3）。分析熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)FN1是MiR-96-5P的直接靶基因。

圖 3 HK2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-96-5P inhibitor和野生型/突變型載體后熒光活性的測(cè)定

3.應(yīng)用于病理研究方面[3]

例如：用質(zhì)粒PGL3-Basic作為載體，將胰島素2啟動(dòng)子插入其中，構(gòu)建帶有熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入胰島β細(xì)胞MIN6中進(jìn)行葡萄糖誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，以利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)胰島素分泌情況[見圖4]。在應(yīng)用PGI3-Basic空白質(zhì)粒代替構(gòu)建質(zhì)粒作為空白對(duì)照的情況下，熒光素酶的檢測(cè)值并沒有隨著不同濃度葡萄糖的誘導(dǎo)發(fā)生改變，而是均停留在較低的水平(圖4A)說明質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染對(duì)試驗(yàn)無影響。使用Renilla luciferase作為內(nèi)參，以去除試驗(yàn)操作等造成的組間差異，結(jié)果表明(見圖4 B、C)每組Renilla的表達(dá)值大體一致，去除內(nèi)參值的影響后各試驗(yàn)組的變化趨勢(shì)與之前相同。

圖 4 不同濃度葡萄糖對(duì)Luciferase表達(dá)情況

4.應(yīng)用于啟動(dòng)子活性分析[4]

例如：開發(fā)并驗(yàn)證了一種單一的分泌性熒光素酶報(bào)告器(SSLR)分析方法用于啟動(dòng)子分析。該方法使用與測(cè)試啟動(dòng)子相關(guān)的分泌性熒光素酶的早期表達(dá)水平，作為同一啟動(dòng)子后續(xù)分析的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化控制（見圖5）。將SSLR分析與使用HMGCR(3-羥基-3-甲基谷糖酰輔酶A還原酶)和LDLR（低密度脂蛋白受體）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的雙熒光素酶報(bào)告器(DLR)分析進(jìn)行比較（見圖6），兩種方法都得到了相似的結(jié)果。比較HMGCR啟動(dòng)子在SSLR瞬態(tài)分析中的反應(yīng)，與同一啟動(dòng)子在穩(wěn)定細(xì)胞系中的反應(yīng)相比非常有利。

圖 5 標(biāo)準(zhǔn)化后每小時(shí)熒光素酶活性

注：將分泌的GLuc數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化到初始分泌時(shí)間點(diǎn)，校正質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的差異。用250或500ng的熒光素酶報(bào)告器結(jié)構(gòu)將HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染6到9小時(shí)。除去轉(zhuǎn)染劑后，每小時(shí)測(cè)量一次分泌性熒光素酶活性。(A)用250或500ng pGluc-promHMGCR轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性。(B)pGluc-promHMGCR熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化至6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。(C)用250或500ng pGluc-promLDLR轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性。(D)pGluc-promLDLR熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為6小時(shí)時(shí)間點(diǎn)。

圖 6 SSLR分析和DLR分析的比較

注：在±25-OHC的情況下，孵育轉(zhuǎn)染pGLuc-promHMGCR、pGL3-promHMGCR/pRL-TK或pGL3-promLDLR/pRLTK或穩(wěn)定的pGLuc-promHMGCRHeLa細(xì)胞株。對(duì)于SSLR分析樣本，在25-OHC處理前6小時(shí)和25-OHC處理16小時(shí)后測(cè)量熒光素酶活性。(A)未標(biāo)準(zhǔn)化下，±25-OHC的HMGCR和LDLR啟動(dòng)子活性。(B)±25-OHC的HMGCR和LDLR啟動(dòng)子活性，在6h時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化為分泌熒光素酶，在DLR試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)化為Renilla。(C)在穩(wěn)定的pGLuc-promHMGCRHeLa細(xì)胞株A6、B2和B3中±25-OHC的HMGCR啟動(dòng)子活性。

Luc細(xì)胞株在成瘤性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的十分廣泛，可以說它所發(fā)出的那點(diǎn)微弱的光芒真的能為癌癥治愈的漫漫長路驅(qū)散一些黑暗。目前，源井生物能提供優(yōu)質(zhì)的Luciferase穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，均穩(wěn)定表達(dá)Luc熒光素酶，可直接應(yīng)用于活體細(xì)胞注射以檢測(cè)細(xì)胞的成瘤性，還具有特異性強(qiáng)且高度靈敏、成像質(zhì)量高、發(fā)光強(qiáng)度可精確定量等優(yōu)點(diǎn)，可以讓研究人員十分精準(zhǔn)地跟蹤自己的細(xì)胞。

參考文獻(xiàn):

[1] 王海娟等，反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Luciferase基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立及其生物發(fā)光成像檢測(cè)[J]，解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37，2-3.

[2] 王薇等，LncRNA_GAS5吸附miR-96-5P加重糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維，[M]，南方醫(yī)科大學(xué)，2020.

[3] 康宇佳, 蒙明慧, 呂忠顯. PGL3-insulin Luciferase質(zhì)粒的構(gòu)建與功能鑒定[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(004):10-15.

[4] Kathy A, et al.A single secreted luciferase-based gene reporter assay[J],Analytical Biochemistry,2014,453 (2014) 44–49.