鱟變形細(xì)胞裂解物?（LAL）?使用者、藥典專家和監(jiān)管機(jī)構(gòu)仍將自己定位于重組因子C?（rFC）?檢測(cè)。藥典標(biāo)準(zhǔn)的更改不會(huì)在一夜之間發(fā)生，目前，愿意更改的用戶必須執(zhí)行替代驗(yàn)證程序?USP <1225>。

在驗(yàn)證替代測(cè)定時(shí)，需要測(cè)定待檢測(cè)雜質(zhì)的特異性。該測(cè)試必須能夠?qū)悠分械碾s質(zhì)與其他無(wú)關(guān)物質(zhì)和雜質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。重組版本的鱟生物傳感器rFC與LAL測(cè)試相比提供了三個(gè)級(jí)別的特異性。本文旨在強(qiáng)調(diào)rFC的三種不同特性，包括?（i）?酶促、（ii）?光譜和?（iii）?遺傳水平特異性。

級(jí)別?1. 酶特異性

C因子生物傳感器與內(nèi)毒素的分子相互作用是在某些無(wú)脊椎動(dòng)物中發(fā)展起來(lái)的一種古老的酶促特異性1，其中酶原蛋白與C因子壽司肽區(qū)域的內(nèi)毒素相互作用并結(jié)合2。這種結(jié)合促進(jìn)了酶原絲氨酸蛋白酶末端（另一端）的特定鍵的斷裂。通過(guò)與內(nèi)毒素的相互作用，C因子分子現(xiàn)在已被“激活”，并且以這種新形式，對(duì)絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)中的下一個(gè)蛋白質(zhì)（B 因子）具有特異性。在重組蛋白的情況下，酶原的活化與具有特異性的小熒光團(tuán)肽進(jìn)行反應(yīng)，其特異性模仿C因子與B因子的相互作用（圖1）。

這是指內(nèi)毒素對(duì)C因子酶原的酶促激活。

源自參考文獻(xiàn)2和3：“在脂多糖介導(dǎo)的C因子活化過(guò)程中，其單鏈形式轉(zhuǎn)化為具有80-kDa 重鏈和43-kDa輕鏈的雙鏈中間形式，輕鏈隨后在獨(dú)特的Phe-Ile鍵上裂解，形成?7.9-kDa A鏈和34-kDa B鏈，并通過(guò)二硫鍵連接在一起。由此產(chǎn)生的三鏈因子C顯示出激活因子B和水解合成三肽底物Boc-Val-Pro-Arg-NH-Np的能力?！?4

一段時(shí)間以來(lái)，人們已經(jīng)知道LAL含有一種替代的酶促途徑，該途徑可以被真菌和纖維素分解副產(chǎn)物激活，稱為?β-葡聚糖途徑。藥物原料和產(chǎn)品中的非內(nèi)毒素LAL反應(yīng)物質(zhì)（LRM）?在最初發(fā)現(xiàn)附加途徑時(shí)引起了相當(dāng)大的關(guān)注。5,6如圖2所示，β-葡聚糖作用于凝血酶而不是C因子。因此，LAL對(duì)內(nèi)毒素不具有特異性，而重組C因子檢測(cè)僅對(duì)內(nèi)毒素具有特異性。LAL用戶可以使用β-葡聚糖封閉緩沖液來(lái)創(chuàng)建專門針對(duì)內(nèi)毒素的LAL測(cè)試，7見(jiàn)圖2。

級(jí)別?2. 光譜特異性

本研究探索了重組C因子熒光分光光度檢測(cè)方法的特異性?；谖舛鹊臏y(cè)試方法（比色法和比濁法）可發(fā)生各種非特異性顏色變化，而重組因子C使用的熒光方法采用非常特定的熒光團(tuán)，具有非常特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。在熒光測(cè)定中，使用特定波長(zhǎng)（380nm）和用于發(fā)射檢測(cè)的不同特定波長(zhǎng)（445nm）的樣品的激發(fā)在執(zhí)行測(cè)定時(shí)提供了另一個(gè)水平的特異性。因此，在顏色變化、光進(jìn)入或其他與化學(xué)變化相關(guān)的事件方面的隨機(jī)干擾對(duì)于熒光測(cè)試是不可見(jiàn)的。

吸光度試驗(yàn)已成功用于LAL顯色和比濁法數(shù)十年。但對(duì)于任何給定的特定樣本，可能需要解決為什么無(wú)法獲得一致的檢測(cè)結(jié)果的問(wèn)題。Geisler列出了一些可能影響吸光度測(cè)定的因素。?

• 選擇性：紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)不會(huì)區(qū)分目標(biāo)樣品和吸收相同波長(zhǎng)的污染物；

• 雜散光：分光光度計(jì)中使用的檢測(cè)器是寬帶的，這意味著它們會(huì)對(duì)到達(dá)它們的所有光做出響應(yīng)。如果樣品中存在反射光的雜質(zhì)，則可能會(huì)記錄錯(cuò)誤的讀數(shù)。雜散光還會(huì)導(dǎo)致吸光度降低，降低儀器的線性范圍；

• 樣品條件：吸收結(jié)果會(huì)受到溫度、pH、雜質(zhì)和污染物的影響。所有這些因素都會(huì)改變樣品的吸收特性，導(dǎo)致讀數(shù)不準(zhǔn)確。

Geisler 還概述了熒光方法的一般優(yōu)勢(shì)。

• 靈敏度：熒光檢測(cè)的靈敏度比吸收分光光度法高約1000倍；

• 特異性：這種方法只檢測(cè)熒光分子，與UV/Vis吸收相比具有更高的特異性；

• 濃度范圍廣：熒光法一般可以檢測(cè)超過(guò)3-6個(gè)對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)的濃度，而無(wú)需稀釋或修改樣品；

• 準(zhǔn)確的結(jié)果：熒光測(cè)量的靈敏度和特異性可能會(huì)帶來(lái)更精確和準(zhǔn)確的讀數(shù)。