這里是專注表觀組學十余年，領跑多組學科研服務的易基因。

羊毛纖維是紡織工業(yè)的寶貴材料，可分為有髓毛（粗羊毛，ALC）和無髓毛（細羊毛，MF），有髓毛由初級毛囊產(chǎn)生，無髓毛由初級或次級毛囊產(chǎn)生。決定羊毛毛囊類型的關鍵時期是胚胎期，這限制了表型觀察和變異對比，導致羊毛類型變異的選擇和研究相當困難。DNA甲基化、重塑、組蛋白修飾、染色質microRNA和長鏈非編碼RNA等不同機制的表觀基因組，與營養(yǎng)、病原體、氣候等環(huán)境因素互作，影響基因的表達譜和特定表型。先前研究發(fā)現(xiàn)，綿羊細毛羊的IRF2BP2基因等是細毛羊中的關鍵基因，但幾乎所有基因變異均基于基因組變異。盡管有一些與羊毛發(fā)育相關的表觀遺傳學研究，但與羊毛發(fā)育相關的關鍵表觀遺傳調(diào)控位點很少被報道。

2023年7月8日，中國農(nóng)業(yè)大學動科院鄧學梅教授團隊在《J Anim Sci Biotechnol》雜志發(fā)表了題為“Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep”的研究論文，該研究從相同基因組背景的同一家族中選擇三對全/半同源的ALC和MF毛羊的采集皮膚組織提取DNA和RNA進行WGS、WGBS、RNA-seq測序分析，揭示了綿羊羊毛類型變異的關鍵基因。

標題：Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep（全基因組DNA甲基化和轉錄組分析揭示了綿羊羊毛類型變異的關鍵基因）

時間：2023-07-08

期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology

影響因子：IF 7

技術平臺：WGS、WGBS、mRNA-seq、RT-qPCR、Western Blot等

研究摘要：

本研究在采用多次排卵和胚胎移植技術（multiple-ovulation and embryo transfer，MOET）培育現(xiàn)代細毛羊(MF)品種的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)有髓毛羊（ALC）。全基因組重測序（WGS）證實ALC羊毛是MF羊毛的變異類型。作者使用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）在4號染色體上定位了顯著相關的甲基化位點，進而將SOSTDC1基因鑒定為ALC羊毛與其半/全同源MF羊毛相比的高甲基化外顯子。轉錄組測序（RNA-seq）結果表明，SOSTDC1在ALC羊毛中表達是MF的數(shù)十倍，且在所有差異表達基因中居首位。對粗/細羊毛品種綿羊的轉錄組比較分析，表明ALC/MF羔羊出生后的差異表達基因和富集通路與羔羊胚胎階段的差異表達基因和富集通路高度相似。進一步實驗證實，SOSTDC1基因在初級毛囊毛乳頭的細胞核中特異性高表達。

本研究對差異羊毛類型性狀進行了全基因組差異甲基化位點關聯(lián)分析，并鑒定出唯一與初級毛囊發(fā)育密切相關的CpG位點。結合轉錄組分析，SOSTDC1被鑒定為該位點上唯一在ALC羊毛羔羊初級毛囊干細胞中特異性過表達基因。這一關鍵基因及其表觀遺傳學調(diào)控的發(fā)現(xiàn)有助于理解細毛羊的馴化和育種。

材料方法

以中國Merino山羊的親緣品種Aohan細毛羊為供體，采用多次排卵和胚胎移植(MOET)法產(chǎn)生ALC和MF羊毛羊羔。從兩個家族共發(fā)現(xiàn)4只ALC毛羔羊，其中一只公羊和兩只母羊的三只ALC雌性羊羔和三只MF雌性羊羔的皮膚組織用于隨后的WGS、WGBS和RNA-seq分析，并用于不同組織的表型測定和基因表達分析。給予相同的生長環(huán)境和飼養(yǎng)條件，在30日齡時，采集每只羔羊中間背側的羊毛纖維，測定羊毛直徑。采集羔羊中間背側1平方厘米皮膚組織，立即用液氮冷凍提取總DNA和RNA，制備皮膚組織冷凍切片。

研究結果

（1）ALC和MF羊毛羔羊的表型比較

圖1：在細毛羊群體中發(fā)現(xiàn)ALC羊毛羔羊。

1. 在P30中出現(xiàn)ALC和MF毛羊羔。

2. MF毛羊羔的羊毛纖維。

3. MF羔羊皮的橫截面和隨后的HE染色。

4. ALC毛羊羔的羊毛纖維。

5. ALC羔羊皮的橫截面和隨后的HE染色。C和E中的橫排為180μm。

6. ALC和MF羊毛直徑的分布。

7. ALC和MF羊毛型羔羊初級和次級毛囊直徑的比較分析。P：初級毛囊，S：次級毛囊。P<0.001.

8. ALC和MF羊毛型羔羊S/P比的比較分析。S/P：次級毛囊數(shù)量與初級毛囊數(shù)量比。P<0.001

（2）WGBS揭示SOSTDC1是與ALC羊毛類型相關的關鍵基因

圖2：通過全基因組甲基化測序（WGBS）揭示關鍵基因。

1. 根據(jù)全基因組重測序數(shù)據(jù)構建不同綿羊品種間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2. ALC和MF組WGBS數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）。

3. ALC與MF羔羊中差異甲基化CpG的曼哈頓圖。

4. 4號染色體和SOSTDC1基因上差異甲基化CpG位點的分布。

5. 基于WGBS和在線預測工具的結果構建了SOSTDC1基因甲基化模式圖譜

（3）轉錄組分析（RNA-seq）揭示ALC羊毛類型的關鍵通路

圖3：轉錄組學數(shù)據(jù)揭示ALC羊毛性狀的關鍵信號。

1. ALC和MF羊毛羔羊RNA-seq數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA）。

2. ALC羔羊中高甲基化基因和上調(diào)的DEG之間的重疊基因。

3. ALC和MF羊毛羊皮中DEG的GO分析和KEGG通路分析。底部X軸表示由相應的基因GO分析和KEGG通路富集分析的P值的負對數(shù)（經(jīng)典Fisher t檢驗）；頂部X軸顯示計數(shù)級別，也以紅色虛線顯示。

4. ALC羊毛羊皮的關鍵候選基因表達

（4）ALC羔羊與現(xiàn)代粗毛羊品種的比較

圖4：利用轉錄組公開數(shù)據(jù)分析粗羊毛和細羊毛品種不同發(fā)育階段的皮膚組織差異表達基因。

1. 粗羊毛品種和細羊毛品種的RNA-seq數(shù)據(jù)分析工作流程。（I）Fastq數(shù)據(jù)檢查和質控（II）reads比對和計數(shù)（III）基因差異表達分析。

2. 不同品種和不同時期綿羊所有表達基因的PCA分析。

3. 粗羊毛和細羊毛品種三個階段的DNMT3A、ARID4A、BRCA1、CTCF基因的TPM平均值條形圖。0.01<P< 0.05，P< 0.001。

4. 粗羊毛和細羊毛品種三個階段的METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPA2B1基因的TPM平均值條形圖。0.01<P< 0.05，P<0.001。

5. ALC羊毛羔羊皮中關鍵表觀遺傳學調(diào)控因子的表達。

圖5：ALC和粗毛羊品種粗毛毛囊形態(tài)發(fā)生的分子機制比較。

1. 利用ALC羊毛羊皮中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因在X軸上取P值log10進行GO和KEGG通路富集分析。紅色條表示胚胎中上調(diào)的差異表達基因，而藍色條表示出生后或成年階段上調(diào)的差異表達基因。數(shù)字表示每次富集的基因數(shù)量。

2. ALC羊毛羔羊和粗毛羔羊品種之間毛囊形態(tài)發(fā)生過程中上調(diào)的DEG重疊。

3. ALC羊毛羔羊和粗毛羔羊品種之間Wnt信號通路中上調(diào)的DEG重疊。

4. 粗、細毛品種不同發(fā)育階段候選基因的表達分析。0.01<P<0.05，P<0.01，P<0.001。

5. 使用在線工具（GeneMANIA：http://genemania.org/)對關鍵蛋白互作網(wǎng)絡進行分析

（5）驗證SOSTDC1作為羊毛毛囊發(fā)育的關鍵候選基因

圖6：SOSTDC1基因表達分析。

1. SOSTDC1在新生階段羔羊不同組織中的相對表達（n=3），不同字母表示組織間顯著差異（P<0.05）。

2. SOSTDC1 mRNA在粗毛和細毛羔羊皮膚組織、ALC羔羊之間的相對表達。ALC毛羊羔：有髓毛羊（n=4） ，Tan lambs：1月齡（n=4） ，Ujimqin lambs：1月齡（n = 4） ，Merino lambs：1月齡的Aohan細毛羊（n=4）；MF毛羊羔：ALC細羊毛羊羔的半/全同源（n=4） 。

3. 使用DANMAN軟件對小鼠、綿羊和人類中SOSTDC1蛋白的氨基酸序列比對。

4. 粗毛和細毛羔羊皮膚組織的SOSTDC1蛋白Western-blot分析。β-actin表示維持蛋白。ALC：有髓毛羊，Tan：Tan羊，Ujimchin：Ujimcchin羊，MF：ALC細毛羊的半同源/全同源，Merino-1和Merino-2表示Aohan細毛羊。

5. 圖像J對D中的Western-blot結果進行灰度分析，0.01<P<0.05。

6. 免疫熒光法檢測ALC羔羊初級毛囊中的SOSTDC1蛋白。左圖：SOSTDC1的免疫熒光染色。中圖：細胞核用DAPI染色。右圖：SOSTDC1（紅色）和DAPI染色細胞核（藍色）的合并免疫熒光圖像。

研究結論：

本研究通過MOET育種在現(xiàn)代細毛羊種群中發(fā)現(xiàn)了有髓毛的新生羔羊（ALC）。使用該模型，發(fā)現(xiàn)最強的差異甲基化位點位于SOSTDC1基因的第二外顯子，與轉錄組分析揭示的SOSTDCC1基因的差異表達相對應。驗證實驗表明，SOSTDC1基因在ALC毛羊毛囊干細胞核中特異性過表達，表明其在初級毛囊發(fā)育中的重要性。本研究為表觀遺傳學在綿毛毛囊發(fā)育中的作用及其在毛羊馴化和育種中的作用提供了新的視角。

關于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標準。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術支持，能廣泛應用在個體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。

易基因全基因組甲基化測序技術通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉變?yōu)槟蜞奏，進而通過接頭序列介導的 PCR 技術將尿嘧啶U轉變?yōu)樾叵汆奏。

應用方向：

WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯過關鍵位點）

• 全基因組甲基化圖譜課題

• 標志物篩選課題

• 小規(guī)模研究課題

技術優(yōu)勢：

• 應用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；

• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；

• 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案。

參考文獻：

Wang J, Hua G, Cai G, Ma Y, Yang X, Zhang L, Li R, Liu J, Ma Q, Wu K, Zhao Y, Deng X. Genome-wide DNA methylation and transcriptome analyses reveal the key gene for wool type variation in sheep. J Anim Sci Biotechnol. 2023 Jul 8;14(1):88.