FlyCut? 酶是一系列能夠快速消化DNA的工程限制性酶。所有FlyCut?酶在通用CutOne中顯示出優(yōu)異的活性? 和CutOne? 彩色緩沖液，能夠在5~15分鐘內消化DNA。這使得任何限制性酶的組合都能在一個反應管中同時工作，并消除了連續(xù)消化的需要。FlyCut? 酶已通過多項嚴格的質量控制，可用于消化質粒、基因組和病毒DNA以及PCR產(chǎn)物。CutOne??Color Buffer包括密度試劑以及紅色和黃色跟蹤染料，可以將反應混合物直接裝載在凝膠上。CutOne的紅色染料? 彩色緩沖液在1%瓊脂糖凝膠中與2.5kb雙鏈DNA片段一起遷移，黃色染料在1%瓊脂凝膠中與10bp雙鏈DNA碎片一起遷移。

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艾美捷快速內切酶EcoRV：

Cat #: C-BSM537

Size: 200 rxns

Storage: -20°C

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快速內切酶EcoRV組分：

推薦反應條件

1x CutOne“”緩沖器；在37°C下培養(yǎng)；有關反應設置，請參閱“快速DNA消化方案”。

熱滅活

在80°C下培養(yǎng)20分鐘。

質量控制

功能測試

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“”EcoRV的CutOne“緩沖液中，在37°C下孵育15分鐘，20μl反應可通過瓊脂糖凝膠電泳確定完全消化。

長時間培養(yǎng)/星形活性測定

在含有1μgλDNA和1μl FlyCut“EcoRV的CutOne”緩沖液中，在37℃下孵育3小時，反應20μl，瓊脂糖凝膠電泳檢測到DNA模式?jīng)]有可檢測的核酸酶降解。長期孵育可能導致星形活性。

結扎和清算

在37℃下用FlyCut’“”EcoRV消化10倍后，在22°C下可將>95%的DNA片段與T4 DNA配體連接。在這些連接的片段中，通過瓊脂糖凝膠電泳測定，>95%可以用FlyCut“”EcoRV重新切割。

非特異性核酸內切酶活性

在含有1μg超螺旋質粒和1μl FlyCut“”EcoRV的CutOne“緩沖液中，在37℃培養(yǎng)4小時，進行20μl反應，通過瓊脂糖凝膠電泳測定，轉化為刻痕或線性形式的轉化率<10%。

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藍/白篩選試驗

用1μl FlyCut消化含有l(wèi)acZα基因的合適載體??EcoRV。將消化產(chǎn)物連接并轉化為大腸桿菌感受態(tài)細胞。在含有X-Gal、IPTG和適當抗生素的Luria Bertani培養(yǎng)板上，成功連接的β-半乳糖苷酶基因可以表達并產(chǎn)生藍色菌落，而中斷基因（即降解的DNA末端）產(chǎn)生白色菌落。FlyCut? 限制性內切酶必須產(chǎn)生少于1%的白色菌落。

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在推薦的反應條件下，該酶可在5~15分鐘內消化單位底物。酶的最適反應溫度為37℃。

當?shù)孜顳NA被CpG甲基化酶甲基化時，這種限制性酶的切割可能被阻斷或受損。

當?shù)孜顳NA被EcoBI甲基化酶甲基化時，這種限制性酶的切割可能被阻斷或受損。

該酶可以在80°C下孵育20分鐘進行熱滅活。孵育3小時不會顯示星形活性，但孵育時間較長可能會導致星形活性。

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快速DNA消化方案：

①?按照指示的順序在冰上混合下列反應組分

Plasmid DNA????PCR product????Genomic DNA

ddH?O????15μl???16μl????30μl

10x CutOne' Buffer or 10xCutOne Color Buffer2μl????3μl2????5μl

DNA????2μl(up to 1μg)???10μ(～0.2μg)????10μl(5μg)

FlyCut" EcoRV?1μl???1μl????5μl

Total????20μl???30μl????50μl

對于純化的PCR產(chǎn)物。如果PCR產(chǎn)物未純化，則10×CutOne的量? 緩沖液應減少到2μl，以減少未純化的PCR產(chǎn)物中剩余的金屬離子。我們建議在消化前純化PCR產(chǎn)物，將其用于克隆，因為一些DNA聚合酶的核酸外切酶活性可能會改變切割DNA的末端

② 輕輕混合并向下旋轉；

③ 在37°C下培養(yǎng)15分鐘（質粒DNA）或15～30分鐘（PCR產(chǎn)物）或30～60分鐘（基因組DNA）；

④可選：在80°C下加熱20分鐘使酶失活；

⑤如果CutOne? 在反應中使用顏色緩沖液，將反應混合物的等分試樣直接裝入凝膠中。