泛素與泛素偶聯(lián)機(jī)泛素是一種小多肽，可以通過其C末端與賴氨酸的胺基結(jié)合靶蛋白上的殘基。這種結(jié)合被稱為單泛素化。附加泛素部分可以利用存在的七個(gè)賴氨酸殘基中的任何一個(gè)與該初始泛素綴合在泛素中。這些泛素鏈的形成被稱為多泛素化。最井這種多泛素化的特征是通過泛素（K48）48位的賴氨酸形成鏈-鏈接的鏈）。單泛素化已被證明可以改變靶蛋白。多泛素化最普遍的結(jié)果是蛋白酶體介導(dǎo)的靶蛋白的降解。

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泛素與靶蛋白的結(jié)合需要三種不同連接酶的協(xié)同功能，E1（泛素激活酶）、E2（泛素偶聯(lián)酶）和E3（泛素連接酶）產(chǎn)生在泛素的C末端和e-賴氨酸的氨基靶蛋白上的殘基。泛素E3連接酶作為支架蛋白，為泛素結(jié)合酶（E2）和靶底物。通常，E3連接酶介導(dǎo)轉(zhuǎn)移泛素從E2硫酯中間體到與底物蛋白的酰胺連接（Hershko和Ciechanover，1998）。除了底物的泛素化，E3連接酶還可以“自動(dòng)”泛素化”本身。

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PROTACs（針對嵌合分子的蛋白質(zhì)水解）人為劫持UPS的成分降解靶蛋白。PROTAC藥物是含有兩個(gè)通過連接體連接的功能配體；一個(gè)配體與靶蛋白結(jié)合，另一個(gè)配體結(jié)合至E3連接酶。理論上，將這兩個(gè)實(shí)體接近會(huì)導(dǎo)致多泛素化和靶蛋白的蛋白酶體降解。然而，考慮到這種情況的復(fù)雜性PROTAC發(fā)現(xiàn)策略面臨著一些挑戰(zhàn)和陷阱。電流在評估PROTAC時(shí)，分析解決了許多這些挑戰(zhàn)，并作為一種有效報(bào)告的工具通過監(jiān)測PROTAC介導(dǎo)的泛素化來實(shí)現(xiàn)真正的PROTAC效率。

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體外泛素化試劑盒以建立一種高通量方法通過監(jiān)測蛋白質(zhì)獲得泛素化的內(nèi)在能力來準(zhǔn)確預(yù)測PROTAC的效率。我們提供了三種E3泛素連接酶Cereblon、VHL和HDM2的試劑盒，以監(jiān)測PROTAC介導(dǎo)的選擇目標(biāo)的泛素化。在測定的核心，微量滴定板條，預(yù)先涂有專有的TUBE試劑（測定板）用于捕獲PROTAC依賴性反應(yīng)。對于測定，首先將PROTAC加入測定板中，然后加入E3連接酶和靶蛋白，使三元復(fù)合物形成。作為一個(gè)序列步驟，將含有wt泛素和ATP的E1-E2酶混合物加入到孔中以啟動(dòng)PROTAC介導(dǎo)的泛素化。在反應(yīng)過程中，E1-E2-E3產(chǎn)生的多泛素鏈機(jī)器被識別并捕獲在井中。在反應(yīng)和隨后的洗滌之后步驟，分離的多泛素化產(chǎn)物與針對感興趣的蛋白質(zhì)的抗體（不是包括）和與HRP綴合的第二抗體（包括），允許通過化學(xué)發(fā)光。因此，在這種情況下，由捕獲的多泛素化產(chǎn)物產(chǎn)生的信號“夾心”ELISA樣測定是PROTAC活性的定量測定。此外檢測策略不需要額外的非天然標(biāo)記或泛素標(biāo)記可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)性偽影。

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建議用途：

1.檢測PROTAC和分子膠（MGs）的活性。

2.比較多種PROTAC變體，并從UbMax中建立預(yù)測DC50。

3.選擇所有三種連接酶來比較PROTACs/MGs活性以證明選擇性。

4.檢測PROTAC底物特異性和異構(gòu)體選擇性。

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艾美捷PROTAC體外泛素化測定試劑盒#PA-0770-P100組件：

1.體外泛素化測定板

注意：不要將分析板快速解凍至室溫。我們建議最初放置

在轉(zhuǎn)移至室溫之前，將測定板在4°C下放置30分鐘。

2.10X含量測定緩沖液

尺寸：1.2毫升

注：添加b-巰基乙醇新鮮至1X測定緩沖液中1mM的最終濃度。

3.E3混合（2X）

尺寸：1 x 250μl（20X）

注：在提供的E3混合物中加入濃度在40-80nM之間的目標(biāo)蛋白

以促進(jìn)與PROTAC和E3連接酶形成三元復(fù)合物。

4.E1-E2-泛素混合物（2X）

尺寸：1 x 250μl（20X）

5.第二抗體（抗小鼠或抗兔HRP綴合物）

尺寸：60μL（100X）

6.檢測試劑1和2

尺寸：1 mL檢測試劑1和1 mL檢測劑2

7.堵劑精礦（5X）

尺寸：5毫升

8.陽性對照試劑

二甲基亞砜中的PROTAC（50X）：10μL（MZP54，dBET6，A1874）

靶蛋白陽性對照BRD3（20X）：20μL

抗BRD3抗體（100X）：5μL

抗小鼠HRP綴合物（100X）：5μL

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PROTAC?體外泛素測定試劑盒：可定制的泛素連接酶試劑盒

1.洗滌緩沖液

a.1倍磷酸鹽緩沖鹽水，0.1%吐溫（PBST）

2.具有發(fā)光功能的讀板器

3.b-巰基乙醇

4.100mM ATP

5.正在研究的PROTAC、靶蛋白和靶特異性抗體（ELISA兼容）

6.聚丙烯板（可選）

7.多通道移液器和自動(dòng)洗板器（可選）

8.15 mL離心管