報(bào)告蛋白是量化基因或者信號(hào)通路活性必可少的工具，其中熒光素酶(Luciferase)因其靈敏度高、檢測(cè)方便，發(fā)光速度快等優(yōu)點(diǎn)，已成為倍受歡迎報(bào)告蛋白。其中最有代表性的是來自螢火蟲體內(nèi)(Fire?y)和海腎(Renilla)體內(nèi)的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。? ??

熒光素酶可以催化底物（luciferin）發(fā)出生物熒光(bioluminescence)，通過熒光測(cè)定儀設(shè)備可對(duì)luciferin氧化過程中釋放的生物熒光進(jìn)行檢測(cè)，常應(yīng)用于雙熒光素的實(shí)驗(yàn)、信號(hào)通路活性的報(bào)告基因、分子間的互作動(dòng)物活體成像示蹤等等。

但是Fluc熒光強(qiáng)度較弱，靈敏度低，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。對(duì)此，漢恒生物在Fluc基礎(chǔ)上研發(fā)了新型的熒光素酶NLuc，經(jīng)過優(yōu)化的Nluc與普通的Fluc相比，發(fā)光強(qiáng)度更高，反應(yīng)速度更快，自發(fā)光的背景更低，靈敏度更高。

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NLuc在熒光素酶相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中的效果。

1. NLuc可以替代FLuc提高雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的靈敏度?

雙熒光素酶報(bào)告基因經(jīng)常用于miRNA與mRNA/lncRNA/circRNA的互作和啟動(dòng)子活性的研究。在啟動(dòng)子活性檢驗(yàn)的研究中，將要研究的啟動(dòng)子序列構(gòu)建到報(bào)告載體中作為螢光素酶的啟動(dòng)子，通過檢測(cè)與地物反應(yīng)釋放的熒光信號(hào)強(qiáng)弱來反映啟動(dòng)子的活力。如果熒光信號(hào)本身較弱，就可能使一些弱啟動(dòng)子序列被判定為陰性，相反，如果熒光信號(hào)較強(qiáng)，那么實(shí)驗(yàn)就可以在更大的區(qū)間內(nèi)量化檢測(cè)結(jié)果的強(qiáng)弱。

以質(zhì)粒為載體，分別轉(zhuǎn)染了Nluc的過表達(dá)質(zhì)粒，F(xiàn)Luc的PGL3質(zhì)粒（pLuc，常見的Fluc的報(bào)告質(zhì)粒）以及Nluc的對(duì)照質(zhì)粒CLuc（與Nluc相同的過表達(dá)質(zhì)粒，但編碼的是傳統(tǒng)Fluc）。通過對(duì)比熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，NLuc產(chǎn)生的信號(hào)要遠(yuǎn)高于FLuc和CLuc（圖1）。

圖1 過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)比不同熒光素酶的熒光強(qiáng)度

2.NLuc構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)株具有更強(qiáng)的熒光信號(hào)?

構(gòu)建熒光素酶過表達(dá)穩(wěn)定株是構(gòu)建報(bào)告基因的工具細(xì)胞或者腫瘤接種示蹤等試驗(yàn)必不可少的環(huán)節(jié)，在這類實(shí)驗(yàn)中熒光信號(hào)越強(qiáng)，背景越弱，越有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。使用慢病毒感染293T細(xì)胞（MOI 10）進(jìn)行建系。20000 cell/well鋪板到96孔板中，每組6孔，培養(yǎng)48h后進(jìn)行檢測(cè)，CLuc與PLuc信號(hào)值無差異，而Nluc是這兩組的兩倍左右，結(jié)果與質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)一致（圖2）。

圖2 293T-Luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株熒光強(qiáng)度的對(duì)比

3.Nluc活體成像效果優(yōu)于其他熒光素酶?

活體成像技術(shù)主要采用生物發(fā)光直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為的技術(shù)，比如可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、示蹤AAV感染效果等等，熒光需要透過皮膚和肌肉才能被儀器檢測(cè)到，因此熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度越強(qiáng)越好，減少背景光對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

使用活體成像儀觀察293T-luc穩(wěn)轉(zhuǎn)系（luciferin濃度150ug/ml），CLuc略好于PLuc，NLuc信號(hào)明顯強(qiáng)于另外兩組（圖3）。

圖3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)活體成像結(jié)果對(duì)比

使用AAV-Luc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞NLuc的信號(hào)強(qiáng)度約為CLuc的3-4倍（圖4）。使用AAV2/8-Luc和AAV2/9-Luc感染293T后檢測(cè)luc信號(hào)，AAV-NLuc分別是CLuc的2.5和5倍（5圖）。

圖4 AAV-luc質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)信號(hào)對(duì)比

圖5 AAV-luc病毒感染293T信號(hào)對(duì)比