01?背景介紹

藥物中元素雜質(zhì)一直是藥物質(zhì)量控制和保證(QC /QA)的重要組成部分，某些元素雜質(zhì)（尤其是重金屬元素）不僅會(huì)對(duì)藥物的穩(wěn)定性、保質(zhì)期產(chǎn)生不利影響，更具有潛在的毒性，易引發(fā)人體疾病[1-3]。因此國(guó)際上近年來(lái)對(duì)藥物中元素雜質(zhì)的控制越來(lái)越嚴(yán)格，歐美早已在藥典和指南中對(duì)元素雜質(zhì)提出明確要求，如 EP 2.4.20.、USP <232>、USP ＜233＞，而ICH Q3D也對(duì)元素雜質(zhì)的分類和控制提出了新的要求。我國(guó)于2017年6月加入ICH后對(duì)元素雜質(zhì)的控制也逐漸接軌國(guó)際。因元素雜質(zhì)的潛在來(lái)源有多處，如何將每種元素雜質(zhì)控制在限度以下，確定元素種類和限度是前提，建立有效的分析方法是關(guān)鍵。本文筆者將重點(diǎn)介紹藥物中元素雜質(zhì)分析方法開發(fā)與驗(yàn)證要點(diǎn)，以供廣大研究者參考。

02法規(guī)指南

2.1?法規(guī)要求

CDE：《化學(xué)仿制原料藥CTD格式申報(bào)資料撰寫要求（[2015]737號(hào)）》附件2中3.2.S.3.2 雜質(zhì)；CDE：《已上市化學(xué)藥品生產(chǎn)工藝變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2017-08-21）》第三章 變更原料藥生產(chǎn)工藝；CDE：《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求（2020-5-14）》第四章 原輔包質(zhì)量控制技術(shù)要求和第五章 質(zhì)量研究與控制技術(shù)要求。2.2 參考指南

EMA：《Guideline on the Specification Limits for Residues of Metal Catalysts or Metal Reagents》；ICH Q3D：Guideline for Elemental Impurities；USP <232> Elements and Limits；USP <233> Elemental Impurities—Procedures；EP 2.4.20. Determination of Elemental Impurities。

03?分析方法開發(fā)流程

元素雜質(zhì)的分析方法開發(fā)主要按下圖中的流程進(jìn)行：

3.1 確定待測(cè)元素種類和限度

3.1.1 確定待測(cè)元素種類

確定待測(cè)元素種類主要依據(jù)ICH Q3D中的要求，全面評(píng)估元素雜質(zhì)的潛在來(lái)源并識(shí)別已知和潛在的元素，元素雜質(zhì)的來(lái)源主要包括：在原料藥、輔料或其他藥品組分生產(chǎn)中有意添加元素（如催化劑）的殘留；非有意添加但在藥品生產(chǎn)所用原料藥、水或輔料中可能存在的元素雜質(zhì)；生產(chǎn)設(shè)備可能引入到原料藥和/或制劑中的元素雜質(zhì)；包裝系統(tǒng)可能浸出至原料藥和制劑中的元素雜質(zhì)；原料藥、輔料和制劑的生產(chǎn)環(huán)境中可能存在的元素雜質(zhì)……圖1可幫助研究者全面、清晰地分析元素雜質(zhì)的潛在來(lái)源。

▲?圖1-元素雜質(zhì)的潛在來(lái)源概覽
ICH Q3D中列舉了24種元素并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行分類，還根據(jù)給藥途徑和是否有意添加確定是否需要對(duì)該元素進(jìn)行控制，如表1所示?！?表1-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需控制的元素雜質(zhì)

以上元素的分類注釋：1類 ：砷、鎘、汞和鉛，毒性明顯，藥品生產(chǎn)中不得使用或限制使用，所有給藥途徑必須對(duì)該 4 種元素評(píng)估；
2A類：鈷、鎳、釩，這些元素在制劑及設(shè)備中出現(xiàn)的可能性較高，需對(duì)所有潛在來(lái)源和給藥途徑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；2B類：元素在藥品中出現(xiàn)的可能性較低，除非在生產(chǎn)中有意添加，否則可不評(píng)估；
3類 ：口服毒性低，對(duì)注射和吸入給藥藥品，若給藥途徑的 PDE（permitted daily exposure，允許日暴露）值不超過(guò) 500 μg/d，則需評(píng)估 ；若該類元素在生產(chǎn)中被有意加入均需評(píng)估；
其他：鋁、硼、鈣、鐵、鉀、鎂、錳、鈉、鎢、鋅等元素，毒性低，未建立 PDE，是否進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需遵從特定元素的其他指導(dǎo)原則和/或地方法規(guī)和規(guī)范或藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；如筆者曾做過(guò)亞甲藍(lán)原料藥中元素雜質(zhì)的研究，其中的鋁、鎂、鐵、錳、鋅五種元素均是參考USP[4]和EP[5]中亞甲藍(lán)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析研究。

3.1.2 確定各元素的限度

各元素的限度確定首先參考ICH Q3D中的計(jì)算方法，如公式（1）。該指南中也列出了不同給藥途徑下1、2、3類元素的PDE值，如表2，可直接運(yùn)用。而其他元素的PDE值并未列出，可通過(guò)動(dòng)物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)后再根據(jù)公式（2）計(jì)算，或參考其他指南和藥品已有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定限度，如EMEA：《Guideline on the Specification Limits for Residues of Metal Catalysts or Metal Reagents》中列出了鐵、錳、鋅的PDE值（見表3）；又如筆者在做亞甲藍(lán)原料藥中元素雜質(zhì)的研究時(shí)，參考的EP亞甲藍(lán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中直接列出了12種元素的限度值（見表4）。

(1)

(2)

式中：NO[A]EL為未見反應(yīng)劑量/未見不良反應(yīng)劑量；若沒(méi)有此數(shù)據(jù)也可使用最低可見反應(yīng)劑量/最低可見不良反應(yīng)劑量（LO[A]EL）；F1到F5為調(diào)整因子，在ICH?Q3D附錄1中均有詳細(xì)描述

▲?表2-各元素PDE值

▲?表3-幾種金屬催化劑或金屬試劑元素的PDE值和限度值

▲?表4-EP中亞甲藍(lán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確立的12種元素的限度值

3.2 前處理方法選擇

樣品前處理是元素雜質(zhì)分析之前的關(guān)鍵步驟。通常情況下，元素雜質(zhì)在復(fù)雜的基質(zhì)中以低濃度存在，因此在樣品前處理中應(yīng)防止元素雜質(zhì)的損失及二次污染。USP ＜ 233 ＞ 規(guī)定了4 種優(yōu)選的前處理方法(圖 2)，其中直接水溶液和間接溶液被采納最為廣泛。

▲?圖2-USP ＜233＞ 規(guī)定的4種優(yōu)選的前處理方法

3.2.1 直接溶解法

對(duì)于微量和痕量元素雜質(zhì)分析而言，優(yōu)先選用無(wú)機(jī)酸或者水簡(jiǎn)單溶解以制備樣品。根據(jù) USP ＜233＞，可溶性固體和液體樣品可用稀硝酸(HNO3 )溶解，或用濃硝酸溶解后加水稀釋以降低酸的濃度，硝酸濃度通常在1%～10%，過(guò)高的硝酸濃度易造成分析時(shí)背景值偏高從而降低儀器分析靈敏度。對(duì)于Hg、Pd、Os、Pt等易揮發(fā)的元素，溶解樣品時(shí)加入?0. 1%～ 1% HCl可以形成金屬絡(luò)合物，確保這些金屬離子在溶液中穩(wěn)定，降低或避免延遲效應(yīng)和記憶效應(yīng)。

對(duì)于汞記憶效應(yīng)，引入Au元素也可起到與 HCl 類似的作用，Au的濃度通常在5～50 ppb。對(duì)于不溶于水的樣品，可用有機(jī)溶劑進(jìn)行溶解，常用的溶劑有二甲基甲酰胺(DMF)、2-丁氧基乙醇、二乙二醇單乙醚(DGME)、乙醇、異丙醇等，但是對(duì)于ICP-OES和ICP-MS而言，過(guò)多有機(jī)物進(jìn)入系統(tǒng)內(nèi)易導(dǎo)致霧化器和等離子矩管積碳、積鹽，進(jìn)而影響儀器靈敏度，因此盡可能不選用有機(jī)溶劑溶解或加入水盡可能降低有機(jī)溶劑的濃度。

直接溶解樣品的方法簡(jiǎn)單、操作步驟少，減少了待測(cè)元素的損失，是液體制劑分析的首選。但是采用 ICP-OES或ICP-MS分析樣品需考慮總固體溶解量(TDS)，一般控制在 1% 以下，TDS 太高易導(dǎo)致霧化器和炬管堵塞，也易造成基質(zhì)效應(yīng)?？刂芓DS最有效的方式就是降低分析時(shí)的樣品濃度。

3.2.2 間接溶解法

對(duì)于原料藥，一些輔料，如粘合劑、著色劑、顏料，以及難以找到合適溶劑溶解的制劑，這些物質(zhì)很難采用直接溶解的方法制備樣品，因此需要采用間接溶解法。間接溶解的關(guān)鍵是要確保樣品完全溶解并且有較低的碳?xì)埩?RCC，或稱有機(jī)物殘留)，重要的是最終樣品溶液的酸度應(yīng)該與標(biāo)準(zhǔn)溶液保持一致，以保證基質(zhì)盡可能一致，否則易造成樣品分析時(shí)內(nèi)標(biāo)漂移。

間接溶解法包括敞開式消解法和密閉消解法，敞開式消解法易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性元素的損失，如 Hg、Os，因此更推薦用密閉消解法（即微波消解法）消解。微波消解法采用密閉的消解罐，避免了樣品在消解過(guò)程中揮發(fā)性組分和元素的損失，也避免了外部環(huán)境的污染。

消解溶劑首選是用濃HNO3，因濃HNO3具有強(qiáng)氧化性，大多數(shù)藥品僅用HNO3即可。對(duì)于有機(jī)物消解不完全的藥品，可采用混合溶劑消解，如HNO3/H2O2(比例通常為2～10:1)，HNO3/H2SO4、HNO3 /HCl、HNO3 /HCl /H2O2。當(dāng)樣品中有二氧化硅(SiO2 )、二氧化鈦(TiO2 )或者滑石粉(Mg3 Si4O10 (OH)2 )時(shí)，需加HF消解樣品，HF的比例通常為HNO3的1/2或1/3。消解之后的樣品一般用水進(jìn)行稀釋，但對(duì)于 Hg、Os 和 Pd等易揮發(fā)性元素，稀釋時(shí)需額外加入穩(wěn)定劑以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，比如筆者通常加入0.5%～1%HCl或Au元素以穩(wěn)定Hg元素；加入0. 01 mol /L硫脲、0. 1 g /L抗壞血酸和?0. 5% 乙酸以穩(wěn)定Os元素。

間接溶解法，尤其是微波消解法很大程度上降低藥品中有機(jī)物的含量，減少了霧化器、等離子體矩管、采樣錐和截取錐的積碳、積鹽，有助于降低基質(zhì)效應(yīng)，是原料藥、難溶性輔料和固體制劑的首選。

3.3 分析技術(shù)選擇

無(wú)機(jī)元素的分析技術(shù)有多種，包括常規(guī)的重金屬檢查法、紫外分光光度法（UV）、原子吸收分光光度法（AAS）、X射線熒光光譜法(XRF)?、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP－OES)和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP－MS)。對(duì)于微量和痕量元素雜質(zhì)而言，最主要采用ICP－OES和ICP－MS，其余的方法都有各自的缺陷，決定了其不適用于多種元素雜質(zhì)的分析，表5清晰地展示了各種分析技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。

▲?表5-常見元素分析技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)匯總

由上表可得，ICP－MS法憑借其眾多優(yōu)點(diǎn)，最適合進(jìn)行多種元素雜質(zhì)同時(shí)分析（尤其是痕量和超痕量雜質(zhì)），所以此法已成為廣大藥研人進(jìn)行元素雜質(zhì)分析的首選。

ICP－MS法通常需要設(shè)置的關(guān)鍵參數(shù)有目標(biāo)同位素、內(nèi)標(biāo)同位素、測(cè)試模式。目標(biāo)同位素首選是自然界中豐度最高的同位素，但也需考慮到同質(zhì)異位素、結(jié)合體（氧化物、氯化物等）的影響，如CO+易干擾28Si的測(cè)定，筆者測(cè)Si時(shí)傾向于選擇29Si；ArCl+易干擾75As的測(cè)定，筆者測(cè)As時(shí)一般不在樣品溶液中加入稀鹽酸；ArO+易干擾56Fe的測(cè)定，筆者測(cè)Fe時(shí)傾向于選擇57Fe……。內(nèi)標(biāo)同位素的選擇原則是不可與目標(biāo)同位素含有同種元素，盡量與目標(biāo)同位素的質(zhì)量數(shù)接近，通常相差不超過(guò)50 amu，因?yàn)橘|(zhì)量數(shù)越接近，同位素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)越接近，電離能越接近，分析時(shí)的響應(yīng)值就越接近，通常內(nèi)標(biāo)同位素的響應(yīng)值不低于目標(biāo)同位素的，若內(nèi)標(biāo)同位素響應(yīng)值過(guò)低容易造成內(nèi)標(biāo)漂移從而失去校正作用，因此內(nèi)標(biāo)同位素的選擇需綜合質(zhì)量數(shù)差異和響應(yīng)值兩方面考慮，比如筆者在做B元素分析時(shí)，一開始選擇6Li作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，其響應(yīng)值僅有9000左右，而11B的響應(yīng)值18000～90000，結(jié)果在測(cè)樣品時(shí)，時(shí)不時(shí)有一針內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值偏高或偏低，相比線性第一點(diǎn)變化達(dá)到20%（通常變化值在±10%說(shuō)明內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定，按此標(biāo)準(zhǔn)6Li只能變化±900），而換成45Sc作為內(nèi)標(biāo)后，由于45Sc的響應(yīng)值在140000左右，內(nèi)標(biāo)的變化值雖然最高增加5000，但也只變化了3.5%，因此45Sc作為內(nèi)標(biāo)非常穩(wěn)定。測(cè)試模式通常分為兩種：標(biāo)準(zhǔn)模式（無(wú)碰撞模式）和碰撞模式，標(biāo)準(zhǔn)模式適用于低質(zhì)量數(shù)的元素，如7Li、9Be、11B等；而碰撞模式適用于大多數(shù)元素，尤其是易于形成結(jié)合體的元素，碰撞氣的存在可將結(jié)合的兩種或多種離子/原子分離，有效解決同質(zhì)異位素的干擾。此外，碰撞模式下碰撞氣流速也是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，流速過(guò)低依然會(huì)存在結(jié)合體的干擾，流速過(guò)高易降低目標(biāo)同位素和內(nèi)標(biāo)同位素的響應(yīng)值，通常流速設(shè)為3～5 ml/min為宜。3.4?分析方法預(yù)驗(yàn)證

當(dāng)確定了前處理方法和分析技術(shù)后，一套元素雜質(zhì)分析方法也就初步開發(fā)建立而成了，在進(jìn)行關(guān)鍵的分析方法驗(yàn)證之前，需進(jìn)行簡(jiǎn)單的方法預(yù)驗(yàn)證，如部分驗(yàn)證和完全驗(yàn)證，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)分析方法中的問(wèn)題，通常進(jìn)行專屬性、線性與范圍、精密度、準(zhǔn)確度這四項(xiàng)驗(yàn)證即可。當(dāng)預(yù)驗(yàn)證結(jié)果符合要求（參考USP <233>和<1225>）后即為正式驗(yàn)證打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

04?分析方法驗(yàn)證項(xiàng)目

藥物分析方法驗(yàn)證實(shí)施通常主要參考ICH Q2、USP <1225>以及ChP 9101，但在以上的指導(dǎo)原則基礎(chǔ)上，元素雜質(zhì)分析又有專門的指導(dǎo)原則，如USP <233>、EP 2.4.20，中國(guó)藥典和歐美藥典中也有關(guān)于ICP-OES和ICP-MS的通則，如USP <730>、EP 2.2.58.和ChP 0412，以下列表是各指南提及的驗(yàn)證項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。

▲?表5-各國(guó)元素分析方法驗(yàn)證參考指南對(duì)比

從上表可清晰得知，中國(guó)藥典至今沒(méi)有專門的元素雜質(zhì)的分析方法指導(dǎo)原則，ChP 0412重點(diǎn)講的是ICP-MS的構(gòu)造、原理和測(cè)試方法，關(guān)于方法驗(yàn)證方面只提及了線性、檢測(cè)限和定量限，USP和EP的指南無(wú)論在元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則還是ICP-MS通則中都詳細(xì)描述了方法驗(yàn)證的各個(gè)項(xiàng)目的要求，參考價(jià)值顯然更高，由于歐美藥典在個(gè)別驗(yàn)證項(xiàng)目的要求略有不同，如定量限、重復(fù)性，因此筆者建議以注冊(cè)申報(bào)為導(dǎo)向選擇主要參考指南：若藥品欲往歐盟申報(bào)，建議優(yōu)先參考EP的指南；若藥品欲往美國(guó)申報(bào)，建議優(yōu)先參考USP的指南；若只是在國(guó)內(nèi)申報(bào)或往其他國(guó)家申報(bào)，筆者建議優(yōu)先參考USP的指南，因USP <233>和<730>幾乎全面提及方法驗(yàn)證的項(xiàng)目，要求描述也最詳細(xì)，是最具參考價(jià)值的，也是國(guó)內(nèi)廣大藥研人進(jìn)行元素雜質(zhì)分析研究的首選。

05?總結(jié)

本文筆者將法規(guī)指南和個(gè)人經(jīng)驗(yàn)有機(jī)結(jié)合，從查閱文獻(xiàn)資料、確定元素種類和限度、方法開發(fā)、方法驗(yàn)證等方面全面描述了元素雜質(zhì)分析方法開發(fā)和驗(yàn)證的要點(diǎn)，希望對(duì)廣大同行有所幫助，不足之處敬請(qǐng)批評(píng)指正！PS：讓我們共同期盼2025版《中國(guó)藥典》收載元素雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則那一天到來(lái)！

參考文獻(xiàn)

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