肝臟作為人體五臟之一，與機體正常的代謝、解毒、凝血等過程息息相關(guān)，并且參與機體免疫，是維持機體生命不可缺少的重要器官。在進行肝臟疾病的研究中，合適的細胞模型是重要的工具之一，但由于常規(guī)肝細胞獲取困難、培養(yǎng)難度高、培養(yǎng)成本高昂，在一定程度上制約了肝臟疾病研究的發(fā)展。因此，在肝臟研究中選擇培養(yǎng)簡單、遺傳背景穩(wěn)定的肝細胞系則成為了一種替代選擇，其中HepG2是最為常用肝癌細胞系之一。

HepG2細胞系的應(yīng)用

HepG2由knowles等建系于1979年，是一種肝母細胞瘤，來源于一名15歲的高加索白人男性肝癌標本。HepG2細胞呈上皮樣形態(tài)，典型染色體數(shù)目為55個。

肝炎病毒研究：HepG2不含hepatitis B virus (HBV)和hepatitis C virus (HCV)，因此HepG2是常用的研究HBV和HCV細胞系模型。

體外HCC模型：HepG2是一種來源于肝細胞癌（HCC）患者肝組織的細胞系，是常見的體外HCC模型。HepG2中p53抑癌基因無突變，因此可用于研究p53與肝細胞癌（HCC）的密切關(guān)系，以及HCC的發(fā)病、診治、預防。

藥物研究：肝臟是人體內(nèi)藥物代謝的最主要器官,也是重要的解毒器官。HepG2細胞系無論在形態(tài)上還是功能上都更接近于人的肝組織，該細胞系常用于藥物代謝和肝毒性研究。

肝細胞系與CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，助力研究肝炎、遺傳病、癌癥等醫(yī)學難題

利用CRISPR/Cas9構(gòu)建基因敲除HepG2的HBV感染細胞模型細胞，為徹底治愈乙肝提供新思路

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是一種DNA病毒，在細胞外的HBV基因組DNA是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxed circularDNA，rcDNA）分子，當病毒感染細胞，HBV基因組進入到宿主細胞核后，rcDNA會在轉(zhuǎn)化成共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circularDNA，cccDNA），并且可以穩(wěn)定存在。目前，不能徹底治愈乙肝的一個重要原因就在于無法清除肝細胞核內(nèi)穩(wěn)定存在的cccDNA。HBV rcDNA向cccDNA的轉(zhuǎn)變是乙肝病毒建立持續(xù)性感染的必需步驟，因此， ? ? ?對HBV cccDNA形成的分子機制的研究對于乙肝治療有深遠意義。

為了探討HBV cccDNA形成的機制，研究者在HepG2中表達HBV的受體——鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白(NTCP)，建立了高效的HBV感染HepG2-NTCP細胞模型，在病毒感染24小時后即可檢測到cccDNA的形成。隨后，使用病毒DNA聚合酶抑制劑以及靶向宿主DNA聚合酶的siRNA進行實驗，結(jié)果顯示HBV 病毒聚合酶在rcDNA轉(zhuǎn)為cccDNA過程中不是關(guān)鍵的因素，而敲降POLK、POLL和POLH能有效降低病毒核衣殼蛋白(HBeAg)和3.5kb vRNA的表達水平，其中敲降POLK顯示了最顯著的效果。

進一步的，利用CRISPR/Cas9在HepG2-NTCP細胞中敲除POLK，可大大減少cccDNA的形成，確認了HBV cccDNA形成過程需要POLK的參與。在POLK敲除的HepG2-NTCP細胞中進行POLK回補，即可恢復HBV cccDNA的合成和病毒蛋白的表達。

該研究有力地表明在HBV感染HepG2-NTCP細胞模型中POLK是HBV cccDNA形成的關(guān)鍵細胞分子，為cccDNA形成的分子機制提供了新的思路，并有助于開發(fā)治療慢性乙型肝炎的新療法。

CRISPR-U?可以十倍高效地將CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)入Hep-G2細胞中 ，篩選后挑取單克隆培養(yǎng)。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。

CRISPR/Cas9構(gòu)建缺失突變細胞HepG2模型，揭秘威爾遜?。╤epatolenticular degeneration）的成因

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration）是一種隱性遺傳病，是由于ATP7B變異引起基因致病性功能喪失。其特征是銅穩(wěn)態(tài)紊亂導致肝臟疾病和神經(jīng)系統(tǒng)異常。NM_000053.3:c.1934T?>?G (Met645Arg) 被報道為復合雜合子，在西班牙血統(tǒng)的患者中高度流行。然而，功能研究表明，該氨基酸的變化并不改變蛋白質(zhì)功能，導致學者質(zhì)疑此突變的致病性。隨后，研究使用一個minigene系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯HepG2細胞來證明c.1934T?>?G導致約70%的6號外顯子跳躍。通過核轉(zhuǎn)染法將CRISPR/Cas9以及ssODN共轉(zhuǎn)入HepG2細胞中，篩選后挑選單克隆培養(yǎng)。對單克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出以下4個克隆進行研究。

與野生型細胞的轉(zhuǎn)錄相比，2F3細胞只有15%的轉(zhuǎn)錄本含有外顯子5，6，7。與野生型細胞相比，1E8和1F6細胞分別只有31%和33%。

此外，從野生型和經(jīng)過編輯的HepG2細胞中提取蛋白裂解物，用western blot檢測ATP7B蛋白的表達。與野生型細胞相比，復合雜合子（2F3）和純合子（1E8，1F6）細胞表達ATP7B水平降低。與2F3細胞相比，1E8和1F6純合子細胞系中ATP7B表達更多。對照組2A1 ATP7B敲除細胞系沒有檢測到ATP7B的水平。?

研究表明，c.1934T?>?G導致約6號外顯子跳躍，從而引起移碼和終止密碼子提前出現(xiàn)，從而導致ATP7B功能喪失。此研究闡明了該點突變在肝豆狀核變性疾病中的機制作用，有助于開發(fā)恢復正確剪接的基因藥物。

HepG2細胞敲入熒光標記基因，為抗炎和腫瘤治療提供了新的技術(shù)支持

mPGES-1是一種末端限速酶（terminal rate-limiting enzyme），負責產(chǎn)生由炎癥誘導的PGE2。mPGES-1的抑制劑被認為是治療炎癥和癌癥的安全有效的靶點。然而，目前還缺乏一種特異、高效、簡便的mPGES-1抑制劑高通量篩選方法。研究者開發(fā)了一種通過CRISPR/Cas9敲入熒光蛋白的一種成像策略來監(jiān)測mPGES-1的表達。

通過使用通過核轉(zhuǎn)染法高效地將gRNA、Cas9和Donor共轉(zhuǎn)入HepG2等肝細胞系中，進行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養(yǎng)。陽性克隆通過免疫熒光共定位、測序、RNAi和IL-1β治療均證實了mPGES-1報告細胞的成功構(gòu)建。

熒光蛋白KI細胞通過4種常用mPGES-1抑制劑處理后，流式細胞儀檢測到熒光信號強度有顯著的衰減，表明該 熒光蛋白KI細胞可作為篩選和優(yōu)化mPGES-1抑制劑的一種高效、簡便的方法。同時，這種KI細胞為靶向小分子化合物的抗炎和腫瘤治療提供了新的技術(shù)支持。

CRISPR-U?可在肝細胞系中進行高效的基因編輯

CRISPR-U是源井生物自主研發(fā)的應(yīng)用于基因編輯細胞系的獨家技術(shù)，通過優(yōu)化基因編輯載體和基因編輯流程，CRISPR-U技術(shù)的基因切割效率和重組效率是普通的CRISPR/Cas9技術(shù)的10倍以上，可輕松定制您感興趣基因編輯肝細胞系細胞系可實現(xiàn)各種轉(zhuǎn)基因的需求。

Reference：

Qi, Yonghe, et al. "DNA polymerase κ is a key cellular factor for the formation of covalently closed circular DNA of hepatitis B virus."?PLoS pathogens?12.10 (2016).

Merico, Daniele, et al. "ATP7B variant c. 1934T> G p. Met645Arg causes Wilson disease by promoting exon 6 skipping."?NPJ Genomic Medicine?5.1 (2020): 1-7.

Chen, Zhanfei, et al. "CRISPR/Cas9-based liver-derived reporter cells for screening of mPGES-1 inhibitors."?Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry?34.1 (2019): 799-807.

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