本文僅為我自己實(shí)驗(yàn)的一個(gè)流程記錄，可能很多地方和大家都不太一樣，僅供大家參考學(xué)習(xí)

1.提蛋白：

蛋白裂解液配方：

RIPA:1ml

PMSF:10μl

Cocktail:20μl

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的PAGE、Western、免疫沉淀(immunol precipitation，IP)、免疫共沉淀(co-IP)和ELISA等。

RIPA裂解液(強(qiáng))的主要成分為50mM?Tris(pH?7.4)，150mM?NaCl，1%?Triton?X-100，1%?sodium?deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白降解。

PMSF:苯甲基磺酰氟是一種不可逆的絲氨酸蛋白酶抑制劑，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶等，、作用原理是特異性識(shí)別并磺化決定酶活性的絲氨酸殘基活性位點(diǎn)。此外，其對(duì)半胱氨酸蛋白酶（如木瓜蛋白酶，DTT逆轉(zhuǎn)其抑制活性）和哺乳動(dòng)物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶也有抑制效果。PMSF常在細(xì)胞或組織裂解之前加入到裂解液中以預(yù)防蛋白的降解。

Cocktail：蛋白酶抑制劑Cocktail是低毒，全面的蛋白保護(hù)試劑，最大限度地保護(hù)蛋白，使其免于被蛋白酶降解。目前生物學(xué)研究日漸深入，更多地將目標(biāo)鎖定為細(xì)胞中較為微量的蛋白，如信號(hào)通路蛋白、受體蛋白，采用coIP,Pull-down等方法獲得樣品。對(duì)于這些微量的珍貴樣品，Cocktail能取得最佳的保護(hù)效果，比單一的抑制劑（如PMSF）更為可靠。

先把蛋白裂解液，EP管（做好標(biāo)記）放在冰上預(yù)冷細(xì)胞培養(yǎng)皿也放在冰上

①4℃預(yù)冷離心機(jī)

②棄去細(xì)胞培養(yǎng)基

③PBS洗三次（貼壁細(xì)胞照常洗，懸浮細(xì)胞加PBS離心洗，盡量吸干凈，避免稀釋蛋白）

④加蛋白裂解液，10cm皿200μl，置于冰上

⑤細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞（懸浮細(xì)胞不需此步）

⑥轉(zhuǎn)到1.5mlEP管中，冰上放置10-15分鐘

⑦12000rmp，4℃離心15min

⑧取上清到EP管中

可放-80℃保存

2.BCA法測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

①蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
? ? a.取1.2ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。 配制后可立即使用，也可以-20℃長(zhǎng)期保存。
????b.取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。例如取20μl?25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入980μl稀釋液即可配制成0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為 了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20℃長(zhǎng)期保存。
②BCA工作液的配制
????根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻。例如5mlBCA試劑A 加100μl?BCA試劑B，混勻，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
③蛋白濃度檢測(cè)
????a.將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。（一般是先加PBS再加標(biāo)準(zhǔn)品，試劑先加多的，再加少的，也就是先按20、19、18、16、12、8、4、0μlH2O于96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，再各加0、1、2、4、8、12、16、20μl標(biāo)準(zhǔn)品）
????b.首先加19μlPBS到96孔板的樣品孔中，再加入1μl 我們步驟一中提取的蛋白上清（設(shè)復(fù)孔）
????c.各孔加入200μl?BCA工 作液，37℃放置20-30分鐘。
注:也可以室溫放置2小時(shí)，或60℃放置30分鐘。BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫 度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間。
????d.用酶標(biāo)儀測(cè)定A562，或540-595nm之間的波長(zhǎng)的吸光度。
????e.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和使用的樣品體積計(jì)算出樣品的蛋白濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到回歸曲線(xiàn)，y為OD值，算出x樣品的蛋白濃度為多少μg/μl

????f.配置WB上樣樣品，如果要配一個(gè)500的體系，500μg需要加多少μl樣本，多少μlH2O，這邊我們是用4X的loadingbuffer，取125μl，配成500μl，就剛好稀釋到1x的工作濃度

loadingbuffer是常用的電泳上樣緩沖液，工作濃度是1X ，主要成分是1 M Tris-HCl（pH 6.8）、?十二烷基磺酸鈉（SDS）、 溴酚藍(lán)、 甘油 、DTT，其中甘油的作用是使樣品沉到點(diǎn)樣孔中而不漂浮起來(lái)；SDS是結(jié)合蛋白質(zhì)，使所有蛋白質(zhì)所帶電荷性質(zhì)一樣，但不同分子量的蛋白結(jié)合的SDS數(shù)量是不一樣的；溴酚藍(lán)是指示劑，可以用來(lái)觀察大概的電泳過(guò)程。DTT還原劑來(lái)讓蛋白質(zhì)充分變性，同時(shí)保護(hù)-SH基團(tuán)內(nèi)含還原劑破壞二硫鍵，而不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，不影響WB檢測(cè)，因?yàn)閃B主要只是測(cè)蛋白表達(dá)量，而不需要蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

????g.95℃煮5min，后可保存于-20℃，剩余樣品放置于-80℃冰箱保存.

3.WB試劑配制

①配置1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)-----高壓蒸汽滅菌

Tris base：72.68g

ddH2O：320ml

測(cè)量PH并定容至400ml

②配置1?mol/L Tris.HCL(PH 6.8)-----高壓蒸汽滅菌

Tris base：18.54g

ddH2O：100ml

測(cè)量PH并加HCL(大約11ml)定容至150ml

③10XRunning Buffer（儲(chǔ)存液）

Tris base：24.2g

甘氨酸：80g

SDS：10g

定容至1L，使用時(shí)，要稀釋成1X工作濃度，即：900mlH2O+100ml10XRunning Buffer

④10X轉(zhuǎn)膜緩沖液

Tris base：30.3g

甘氨酸：144g

定容至1L，使用時(shí)，要稀釋成1X工作濃度，即：800mlH2O+100ml10X轉(zhuǎn)膜緩沖液+100ml甲醇

⑤10xTBS（Tris緩沖鹽水--洗膜時(shí)用）（儲(chǔ)存液）（PH?6.8）

Tris base：24.2g

NaCl：80g

ddH2O：900ml

測(cè)量PH并加HCL(大約12ml)定容至1L，使用時(shí)，要稀釋成1X工作濃度，即：900mlH2O+100ml10XTBS

TBST：含0.1%吐溫-20的1XTBS，即：1ml吐溫-20+1000ml的1XTBS

⑥配置分離膠與濃縮膠

注意：TEMED最后加，下圖中8ml與15ml大約為兩塊1.5mm的板

4.SDS-PAGE電泳

①配膠前先將板子弄好（將玻璃板對(duì)齊后放入卡緊，小心放置玻璃片）

②分離膠配好加入板子中

③加入ddH2O（異丙醇也可以）封閉（加滿(mǎn)），室溫放置15-20min后倒掉水，用剪好的濾紙條吸干水

④濃縮膠配好加入板子中（濃縮膠分離膠可以同時(shí)配置，但濃縮膠用時(shí)再加TEMED）

⑤插梳子（沿著一邊插，盡量避免氣泡）室溫放置20-30分鐘后放入電泳槽，并往內(nèi)槽中注滿(mǎn)電泳液

⑥拔梳子：緩慢垂直拔（如遇孔內(nèi)堵塞，可用槍頭吹吸或針頭挑，若孔內(nèi)膠條歪了，用針頭挑正）

⑦緩慢加入樣本20μl （注意樣本順序）最左側(cè)加marker4μl ，最右側(cè)加marker2ul

⑧補(bǔ)充足夠電泳液后開(kāi)始電泳（外槽頁(yè)面需超過(guò)金屬絲）電泳液可回收兩次

⑨濃縮膠電壓約80V 30min

????分離膠120V，根據(jù)目的蛋白的大小來(lái)判斷時(shí)間

5.轉(zhuǎn)膜

①準(zhǔn)備2張的濾紙和2張8.5cm x 6cm的PVDF膜（或NC膜），切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的PVDF膜用甲醇浸泡2-3min，顏色有變化（或下沉）即可轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中浸泡。（甲醇可以倒入后續(xù)的轉(zhuǎn)膜液中）

②在加有轉(zhuǎn)膜液的搪瓷盤(pán)里按照“三明治”結(jié)構(gòu)組裝轉(zhuǎn)膜夾

????三明治結(jié)構(gòu)：黑板-海綿墊-濾紙-膠--PVDF膜-濾紙-海綿墊-白板（黑膠白膜）

????注意膠與膜之間不能有氣泡

③將“三明治”放入轉(zhuǎn)膜裝置（黑對(duì)黑，白對(duì)紅）（注意膜的正反）

④倒入4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液（現(xiàn)配現(xiàn)用，防止甲醇揮發(fā)），放入冰盒，在冰盒中轉(zhuǎn)膜

150mA 2h（20kD~55kD）——200mA 1h15min

⑤轉(zhuǎn)完后將膜用1×TBST 在搖床上搖動(dòng)洗滌5min（注意正反面，右上角剪一點(diǎn)）

⑥封閉：5%脫脂牛奶常溫封閉1h（或用5%BSA：磷酸化蛋白常用BSA封閉）

⑦用1×TBST?在搖床上搖動(dòng)洗滌5min，根據(jù)目的條帶大小剪去膜條進(jìn)行后續(xù)免疫反應(yīng)

6.免疫反應(yīng)

①將一抗用TBST（或牛奶或BSA）稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋瑢⑺鶞y(cè)的蛋白區(qū)段條帶放到孵育盒里，加入稀釋好的抗體4℃搖床過(guò)夜孵育（60速）。注：一抗內(nèi)參常用beta-actin或beta-Tubulin，GAPDH易受影響，內(nèi)參常按1：4000稀釋?zhuān)灰豢钩０?：2000稀釋

②將條帶從一抗中取出，放到TBST中搖床洗滌3次，10min/次

③使用相應(yīng)的二抗，將二抗用TBST稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋瑢⑺鶞y(cè)的蛋白區(qū)段條帶放到孵育盒里，加入稀釋好的抗體搖床孵育2-3h（二抗常按1：4000稀釋?zhuān)?/p>

④將條帶從二抗中取出，放到TBST中搖床洗滌3次，10min/次

7.化學(xué)發(fā)光顯影

8.時(shí)間安排

第一天：配各種液+配膠

第二天：上樣+電泳+轉(zhuǎn)膜+孵一抗過(guò)夜

第三天：孵二抗+洗二抗+顯影