帶你全面了解腺病毒(adenovirus, Ad)包裝體系之包裝過(guò)程

2023-07-05 17:14 作者:小恒學(xué)術(shù) 0人讀過(guò) | 我要投稿

????在前面干貨中已經(jīng)給大家介紹了腺病毒載體及其包裝系統(tǒng)，本期小編繼續(xù)給大家分享AdMax和Adeasy系統(tǒng)的包裝流程。

一、整體實(shí)驗(yàn)流程

圖1 腺病毒兩種包裝系統(tǒng)流程圖

二、實(shí)驗(yàn)材料

三、腺病毒包裝和純化

1.?????? 質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增

AdMax系統(tǒng)：構(gòu)建有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒，大量抽提并去除內(nèi)毒素，用于轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。

Adeasy系統(tǒng)：構(gòu)建連接目的基因的pHBAdEasy質(zhì)粒并進(jìn)行酶切線性化；線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)（含pAdEasy-1骨架質(zhì)粒）進(jìn)行重組，涂板培養(yǎng)單克隆并擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PacI酶切驗(yàn)證；驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)，得到高純度的重組質(zhì)粒并進(jìn)行PacI酶切線性化，用于轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞。

2.?????? 腺病毒包裝

表2 腺病毒包裝體系

? ? ? ?這里是以6cm培養(yǎng)皿為例的質(zhì)粒參考用量。待293A細(xì)胞匯合度達(dá)到50%-70%時(shí)，備好病毒質(zhì)粒、37℃預(yù)熱好的DMEM、室溫的轉(zhuǎn)染試劑，按操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮培養(yǎng)基。

3.?????? 腺病毒收集

病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成。為了限制病毒的擴(kuò)散而讓空斑更好地形成，可在培養(yǎng)液中加入低熔點(diǎn)瓊脂糖，一般在轉(zhuǎn)染后第10至21天可以在顯微鏡下看到小的空斑。挑取 3-6 個(gè)空斑不等，放入1 ml新鮮培養(yǎng)基中過(guò)夜，然后比較滴度，使用滴度最高的一個(gè)空斑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.?????? 腺病毒擴(kuò)增

將培養(yǎng)基中的病毒加入新鮮293A細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行病毒少量擴(kuò)增。至再次出現(xiàn)空斑，收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次收集病毒（P1代），感染293A細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行三代感染，至P4代進(jìn)行腺病毒的大量擴(kuò)增并收集病毒。

5.?????? 腺病毒純化

將病毒從-80℃冰箱取出，室溫水浴融化。7000×g 4℃離心10min，棄細(xì)胞碎片，收集上清，0.22μm過(guò)濾除菌即可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。若用于對(duì)腺病毒滴度和純度要求高的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，則需要采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法進(jìn)行純化（方法如下）。

①PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間）。7000×g 4℃離心上述混合物 20 min，棄上清，將沉淀物懸浮在10 ml密度為1.10 g/ml的CsCl溶液中（溶劑為20 mM Tris-HCl，PH8.0），病毒液應(yīng)呈粉紅色。

②CsCl梯度離心：加入2 ml密度為1.40 g/ml的CsCl溶液，然后再緩慢加入3 ml密度為1.30 g/ml的CsCl溶液，再加入5 ml的病毒懸浮液。使用Beckman SW28轉(zhuǎn)子，26,000 rpm，4℃離心2小時(shí)。

表3、三種不同密度CsCl溶液的配制?