今天給大家剖析這篇2023.2.13發(fā)表在大子刊Cancer cell的研究論文。本文由四川大學(xué)華西醫(yī)院團隊完成！

本研究基于胰腺癌原發(fā)組織、肝轉(zhuǎn)移組織、門靜脈血循環(huán)腫瘤細胞（CTC）三種類型樣本的單細胞測序。樣本來源于6例具有肝轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者，且均未經(jīng)過任何治療，每個患者分別取胰腺癌原發(fā)組織、肝轉(zhuǎn)移組織、CTC三種類型樣本，共計18個樣本。

其中同時從一個患者獲取胰腺癌原發(fā)癌組織和肝轉(zhuǎn)移組織相對較難，CTC獲取更難（1ml血液僅含有1-50個CTC，本研究基于微流控芯片技術(shù)分選CTC），因此，本研究樣本具有珍貴稀有特性。這也為本研究在臨床意義上打下了較好的基礎(chǔ)，符合目前Cancer cell大子刊接收文章的定位（偏臨床、偏應(yīng)用）。當(dāng)然，本文的機制研究也比較出彩。

本研究提出并證實的work model為：靜脈血中的CTC通過表面分子HLA-E與NK細胞表面NKG2A互作，抑制NK細胞對CTC的殺傷，促進腫瘤轉(zhuǎn)移。在此選題基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)進行機制研究，闡明了CTC如何上調(diào)HLA-E的詳細分子機制。

那么提出以上work model的底層邏輯是如何逐步完成的呢？

#1.?首先，對以上18個樣本的所有細胞單細胞測序結(jié)果聚類分析，可以看到CTC是一群明顯不同于原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶（Epithelial）的腫瘤細胞。

#2.?接著，分析了CTC和原發(fā)/轉(zhuǎn)移灶腫瘤之間差異基因，展示了最高/最低變化的30個差異基因（D），發(fā)現(xiàn)紫色標(biāo)注的在CTC顯著上調(diào)的是血小板相關(guān)基因，提示腫瘤和血小板之間可能存在相關(guān)性。并對這三類腫瘤細胞各類基因集（免疫、血小板、腫瘤發(fā)生、EMI、生物合成、凋亡、代謝和細胞周期等）的富集得分進行展示，同樣包含血小板相關(guān)基因集。提示CTC和血小板聚集和激活顯著相關(guān)，CTC的轉(zhuǎn)移很可能和血小板相關(guān)。

#3.?為探究CTC和免疫細胞之間的互作，繼續(xù)分析了三種組織樣本中腫瘤細胞/CTC和各類免疫細胞之間的細胞通訊（基于受配體對）。結(jié)果表明，在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶，腫瘤細胞和其他各類免疫細胞互作差別不大，但在血液中CTC和NK之間的互作通訊最為強烈，因此進一步分析NK和CTC之間的互作。

通過受配體對分析發(fā)現(xiàn)，CTC表面HLA-E和NK表面NKG2A相互作用，而NKG2A是NK細胞表面一種已知的免疫抑制分子，因此，可以提出猜想：CTC通過HLA-E集合NK表面NKG2A，抑制NK對CTC殺傷，導(dǎo)致CTC免疫逃逸，促進轉(zhuǎn)移。

#4.?接著，比較了CTC和原發(fā)及轉(zhuǎn)移腫瘤細胞表面HLA-E表達，發(fā)現(xiàn)CTC特異高表達HLA-E。

為了揭示CTC為何高表達HLA-E，本研究利用單細胞數(shù)據(jù)分別找到CTC與原位、轉(zhuǎn)移腫瘤細胞之間的差異基因（DEGs）,然后計算CTC中的HLA-E表達水平和DEGs之間相關(guān)性。挑選CTC與原發(fā)/轉(zhuǎn)移DEGs中最正相關(guān)的4個基因（A圖）進行功能驗證（B），證實RGS18可以最顯著上調(diào)腫瘤細胞高表達HLA-E。據(jù)此提出猜想：CTC通過RGS18上調(diào)HLA-E，與NK細胞NKG2A互作，抑制NK效應(yīng)。

#5.?接著，繼續(xù)回答CTC如何獲得RGS18。文獻報道，RGS18主要來源于血小板，而前面第一部分?jǐn)?shù)據(jù)提示CTC和血小板之間存在明顯相關(guān)，另外實驗?zāi)[瘤細胞可以攝取血小板（圖A）。因此，提出猜想：CTC通過攝取血小板獲得RGS18。并通過后續(xù)實驗證實了猜想。

#6.?接著，繼續(xù)探究RGS18如何上調(diào)CTC細胞HLA-E。文獻報道，RGS18通過GPCR調(diào)控下游通路，本文通過Western Blot篩選了GPCR下游的一些激酶，發(fā)現(xiàn)RGS18過表達可以顯著影響AKT通路。另有文獻報道，CREB可以直接調(diào)控HLA-E表達，而且AKT可以通過GSK3β激活CREB。綜合文獻加實驗結(jié)果，進行邏輯串聯(lián)，提出科學(xué)猜想，CTC細胞中，RGS18通過AKT-GSK3β-CREB軸調(diào)控HLA-E上調(diào)。并通過后續(xù)實驗進行了證實。

綜合以上六方面，進行邏輯串聯(lián)，本研究提出work model并進行詳細機制探究，完善后的work model如下：靜脈血中的CTC攝取血小板，獲取血小板中的RGS18，RGS18通過AKT-GSK3β-CREB上調(diào)HLA-E與NK細胞表面NKG2A互作，抑制NK細胞對CTC的殺傷，促進腫瘤轉(zhuǎn)移（如下圖）。

通過以上邏輯重建，我們大概可以猜到本研究如何從課題構(gòu)思到逐步設(shè)計完成work model構(gòu)建。以下代表個人理解及觀點，僅供參考：

1. 腫瘤轉(zhuǎn)移進程會進入血液，形成CTC，CTC之所以能夠進行遠處轉(zhuǎn)移，重要原因之一是在血液中逃脫免疫殺傷。本研究聚焦于血液CTC免疫逃逸，促進腫瘤轉(zhuǎn)移的細胞分子機制；

2. 通過單細胞測序分析，發(fā)現(xiàn)血液CTC和NK細胞互作最顯著，所以猜想，CTC應(yīng)該通過針對NK產(chǎn)生免疫抑制，大致免疫逃逸；受配體對找到CTC表面HLA-E與NK細胞表面NKG2A結(jié)合；而NKG2A是導(dǎo)致NK免疫抑制的分子，因此以上猜想邏輯上成立；

3. 于是接下來比較了CTC和原發(fā)及轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞HLA-E表達，發(fā)現(xiàn)顯著高表達；接著探究CTC如何上調(diào)HLA-E，通過相關(guān)性分析并驗證找到RGS18；通過文獻可知RGS18主要來源于血小板，加上之前有文獻提示腫瘤細胞和血小板有緊密接觸，考慮到膜膜融合，因此邏輯上腫瘤細胞可攝取血小板內(nèi)容物，并進行了證實；

4. 最后找RGS18如何上調(diào)CTC細胞HLA-E表達，此時通過反向文獻研究，發(fā)現(xiàn)HLA-E轉(zhuǎn)錄可以被CREB直接調(diào)控，而AKT-GSK3β可調(diào)控CREB，接下來邏輯環(huán)路只差檢測RGS18是否可以直接影響AKT通路。而文獻報道RGS18通過GPCR調(diào)控下游通路，GPCR下游為激酶，其中包括AKT，因此進行排除實驗，發(fā)現(xiàn)RGS18只能影響AKT。如此，以上形成邏輯閉環(huán)，提出并證實了RGS18通過AKT-GSK3β-CREB上調(diào)HLA-E。

5. 基于以上work model的提出并建立，回頭進行Figure 1數(shù)據(jù)補充，那就是，CTC與原發(fā)、轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞相比的DEGs應(yīng)該包含與血小板相關(guān)基因，而基因集富集分析中，CTC也高表達血小板相關(guān)基因集。綜上，本研究從Figure1-Figure7形成邏輯閉環(huán)！

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