樣品的常見問題

1.1 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡(jiǎn)寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛取?duì)于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

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1.2 細(xì)胞水平要做Western Blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠Western Blot？

解答：一般地5 x 106就足夠了。

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1.3 同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白嗎，這樣對(duì)Western Blot有無影響?

解答：能，沒有問題，我們做過。

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1.4 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？

解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。

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1.5 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

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1.6 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？

解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，多加5－10％甲醇。

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1.7 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？

解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6％， Stacking Gel 3.5％。

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1.8?如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。

解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。

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1.9 蛋白變性后可以存放多久？

解答：－80℃，一兩年沒有問題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

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1.10 我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05ＫＤ的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。

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1.11 一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

解 答：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽 性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適 合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

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1.12 做組織樣品的western的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？

解答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑 cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用ＢＳＡ也是不錯(cuò)的選擇。

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1.13 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

解答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

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1.14 有什么方法可以提高上樣量？

解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。

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1.15 我要檢測(cè)的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機(jī)，有沒有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？

解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個(gè)做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機(jī)。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉(zhuǎn)移方法實(shí)施。

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1.16 蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

解答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3μg/mm2。

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1.17 一抗，二抗的比例是否重要？

解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

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