導(dǎo)語

心臟是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)生過程中第一個(gè)發(fā)育的器官，其由四個(gè)腔室組成：左心房（LA）、右心房 （RA）、左心室（LV）和右心室（RV），每個(gè)腔室又由心外膜、心肌和心內(nèi)膜三層組織組成。心肌由心肌細(xì)胞（CM）、成纖維細(xì)胞（Fb）和冠狀動(dòng)脈血管相關(guān)細(xì)胞類型組成；心外膜主要由心外膜細(xì)胞（Epi）組成，心內(nèi)膜則含有心內(nèi)膜/內(nèi)皮細(xì)胞（Endo_EC）。在功能層面，Wilms’ tumor 1（Wt1）和T-Box轉(zhuǎn)錄因子18（Tbx18）是心臟發(fā)育的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其不僅在心外膜細(xì)胞中高度表達(dá)，在其他心臟譜系的早期階段也有表達(dá)。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）是在單細(xì)胞水平上研究心臟發(fā)育的有力方法。先前的研究已通過譜系追蹤小鼠等鑒定了小鼠心臟的不同祖細(xì)胞群體和新的細(xì)胞亞群，但這些研究所囊括的細(xì)胞數(shù)量較少且大多數(shù)細(xì)胞是CM，限制了對(duì)非CM譜系的下游分析，而非CM譜系對(duì)心臟的發(fā)育和功能行使是至關(guān)重要的。因此，生成一個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集來捕獲每一種主要的心臟細(xì)胞類型十分有必要。此外，對(duì)Wt1和Tbx18突變體的單細(xì)胞評(píng)估也將為了解心外膜在整個(gè)心臟發(fā)育過程中的功能提供見解。

近日，美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表了題為“Single-cell transcriptomic analysis identifies murine heart molecular features at embryonic and neonatal stages”的文章。研究團(tuán)隊(duì)使用多路復(fù)用策略（MULTI-seq），在保留發(fā)育階段和腔室特性的情況下，對(duì)CD1小鼠中的72個(gè)樣本和C57BL/6小鼠的68個(gè)樣本進(jìn)行了分析，生成了一個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集。通過系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，研究團(tuán)隊(duì)識(shí)別了每個(gè)細(xì)胞譜系中的發(fā)育階段、腔室和細(xì)胞周期階段特異性基因特征；發(fā)現(xiàn)了先天性心臟?。–HD）相關(guān)基因的細(xì)胞類型和階段特異性富集。此外，研究團(tuán)隊(duì)還使用Wt1和Tbx18突變體揭示了心外膜源性生長(zhǎng)因子在心臟發(fā)育過程中的功能。

主要研究?jī)?nèi)容

胚胎期和新生兒期心臟細(xì)胞類型鑒定

研究團(tuán)隊(duì)使用MULTI-seq分析了從E9.5到P9等多個(gè)階段的心臟樣本，這些階段包括心臟的主要發(fā)育點(diǎn)，如四腔室的形成、冠狀動(dòng)脈血管的形成、出生和心肌細(xì)胞再生、喪失等。通過對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，將來自CD1和C57BL/6小鼠的細(xì)胞分為24個(gè)和27個(gè)亞群。

基于先前發(fā)表的數(shù)據(jù)和特征性基因的表達(dá)，研究團(tuán)隊(duì)注釋了單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞類型。基于泛CM基因Ttn、心房特異性CM基因Sln和心室特異性CM基因Myl2的表達(dá)，鑒定出代表心房CM（Atrial_CM）和心室CM（Ven_CM）的細(xì)胞亞群。基于泛EC基因Pecam1、心內(nèi)膜EC基因Npr3和冠狀動(dòng)脈血管EC基因Fabp4的表達(dá)，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了與心內(nèi)膜EC（Endo_EC）、血管EC（vas_EC）相對(duì)應(yīng)的亞群以及Wt1、Tbx18和Aldh1a2的高表達(dá)的Epi亞群。此外，研究團(tuán)隊(duì)還根據(jù)Postn和Pdgfrb的表達(dá)分別定義了成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（Fb_like）和壁細(xì)胞。有趣的是，依據(jù)平滑肌細(xì)胞基因Myh11和周細(xì)胞基因Pdgfrb的表達(dá)，壁細(xì)胞可以進(jìn)一步分為平滑肌細(xì)胞（SMC）和周細(xì)胞。

發(fā)育階段特異性分子的鑒定
在UMAP降維圖上，研究團(tuán)隊(duì)觀察到除壁細(xì)胞和免疫細(xì)胞外，所有細(xì)胞類型都是按發(fā)育階段進(jìn)行聚類的。大多數(shù)早期胚胎階段的細(xì)胞聚集在UMAP圖的一端，新生兒階段的細(xì)胞聚集在另一端，晚期胚胎階段的細(xì)胞分散在兩者之間。
為確定每種細(xì)胞類型的階段性分子特征，研究團(tuán)隊(duì)首先識(shí)別了在擬時(shí)序分析階段差異表達(dá)的基因，并分析了由具有類似表達(dá)模式的基因表達(dá)模塊。結(jié)果顯示，大多數(shù)譜系定義基因模塊在相鄰階段富集，并分為兩類：早期胚胎期或晚期胚胎/新生兒期的組合。此外，早期階段的模塊中富集了與譜系發(fā)育和形態(tài)發(fā)生相關(guān)的基因；新生兒階段的模塊中主要包含與譜系成熟和細(xì)胞功能相關(guān)的基因。

CHD相關(guān)基因表達(dá)譜分析
該研究提供的scRNA-seq數(shù)據(jù)集包含了來自每個(gè)主要心臟發(fā)育階段的心臟譜系細(xì)胞，在評(píng)估與CHD相關(guān)的基因表達(dá)模式方面具有重要價(jià)值。研究團(tuán)隊(duì)使用scRNA-seq數(shù)據(jù)集評(píng)估了一組已知的CHD相關(guān)基因，包括前期發(fā)表的涉及人類CHD的基因和導(dǎo)致小鼠CHD的基因。研究團(tuán)隊(duì)確定了能夠顯示細(xì)胞類型偏好表達(dá)模式的基因簇。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在心房和心室CM中高度表達(dá)的基因簇，包括Nkx2-5、Myh6、Tbx5和其他10個(gè)基因，這些基因與CHD如房間隔缺損（ASD）和室間隔缺損（VSD）相關(guān)。Endo_EC基因簇有9個(gè)基因（包括Notch1和Foxc2），其在所有階段都有表達(dá)并優(yōu)先與左心發(fā)育不良綜合征（HLHS）、雙尖瓣主動(dòng)脈瓣（BAV）和法洛四聯(lián)癥（TOF）相關(guān)。此外，研究團(tuán)隊(duì)還鑒定了Vas_ECs、壁細(xì)胞和免疫細(xì)胞的基因簇。

Wt1和Tbx18突變體心外膜功能的研究
心外膜細(xì)胞是調(diào)節(jié)心臟發(fā)育的生長(zhǎng)因子的樞紐。研究團(tuán)隊(duì)使用了兩個(gè)攜帶心外膜轉(zhuǎn)錄因子Wt1和Tbx18突變的小鼠品系，通過MULTI-seq在多個(gè)階段分析了兩個(gè)突變體，以獲得其缺陷的系統(tǒng)圖譜。通過與對(duì)照組進(jìn)行比較，研究團(tuán)隊(duì)在Wt1突變體中發(fā)現(xiàn)了一組異常表達(dá)的基因，包括Wt1、Aldh1a2、Rspo1、Tms4f5和Tm4sf1等。
接下來，研究團(tuán)隊(duì)比較了Wt1和Tbx18突變心外膜細(xì)胞中異常表達(dá)的基因，并在E14.5處確定了這兩個(gè)突變體共享的一組基因。對(duì)共享基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，其在Wnt信號(hào)負(fù)調(diào)控和細(xì)胞外基質(zhì)組裝通路等多個(gè)通路中富集。此外，在這些共享基因中，生長(zhǎng)因子包括Bmp4、Apoe和Cdh3在突變體中上調(diào)，而Wnt5a、ntnt和Tgfb2在突變體中下調(diào)

圖4.?Wt1和Tbx18突變體對(duì)心臟發(fā)育的影響。來源：Nature Communications

結(jié)語

綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)使用MULTI-seq在單細(xì)胞層面分析了胚胎和新生兒階段的心臟細(xì)胞，這個(gè)龐大的數(shù)據(jù)集可以作為將來研究哺乳動(dòng)物心臟發(fā)育的優(yōu)質(zhì)資源。通過scRNA-seq分析兩種心外膜表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Wt1和Tbx18的突變，研究了心外膜功能并發(fā)現(xiàn)了不同類型細(xì)胞的異常，對(duì)未來心臟生理和病理的研究具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

Feng, W., Bais, A., He, H. et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies murine heart molecular features at embryonic and neonatal stages. Nat Commun 13, 7960 (2022).?https://doi.org/10.1038/s41467-022-35691-7