自2009年荷蘭科學(xué)家Hans Clevers團隊成功將Lgr5+腸道干細(xì)胞在體外培養(yǎng)成具有三維結(jié)構(gòu)的小腸類器官模型之后，類器官的研究進入新時代，相關(guān)文章如雨后春筍一般，不斷涌現(xiàn)。

僅過去的2023年上半年，“Organoid”相關(guān)文章就有2194篇，遠(yuǎn)超前幾年同期水平，意味著該領(lǐng)域的研究熱度還在升溫。

那么作為當(dāng)前全國乃至全球生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最受關(guān)注的熱點之一，類器官究竟是何方神圣？又有哪些神通？今天就與大家一起梳理一下。

一、 類器官的概念

類器官是指在體外三維（3D）環(huán)境中培養(yǎng)生長的微型細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇在細(xì)胞因子、化學(xué)小分子抑制劑/激活劑、培養(yǎng)基及其他添加劑等物質(zhì)作用下，經(jīng)過自組織并分化為功能性細(xì)胞群，具有類似相應(yīng)器官的組織結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)特點。

類器官不是真正意義上的器官，但是它能夠最大程度上模擬體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且能長期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，因此也被稱為“微型器官”。

二、 類器官的發(fā)展史

早在1907年，Henry Van Peters Wilson就進行了體外有機體再生的嘗試，他的研究證明了分離的海綿細(xì)胞有自組織再生整個生物體的潛力；1994年，研究者對兩棲動物原腎進行解離驗證了組織細(xì)胞具有再聚集的能力；1961年，研究者描述了胚胎體在體外的分化；1981年，研究人員從小鼠胚胎中建立多能干細(xì)胞（PSCs），并創(chuàng)造了“胚胎干細(xì)胞（ESCs）”這一術(shù)語，自此干細(xì)胞研究蓬勃發(fā)展。

1987年，研究人員在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）提取物上生長的乳腺上皮組織生成了三維導(dǎo)管和小管；同年，另一個研究證實肺泡II型上皮細(xì)胞能夠在ECM基質(zhì)存在下維持其分化；凸顯了細(xì)胞-基質(zhì)相互作用在組織維持和分化中的重要性。

2008年，Eiraku等人使用3D聚集培養(yǎng)方法從ESCs產(chǎn)生大腦皮層組織；2009年，Hans Clevers團隊成功將Lgr5+腸道干細(xì)胞在體外培養(yǎng)成具有三維結(jié)構(gòu)的小腸類器官模型，它能自組織并分化為隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)，這一事件也成為了類器官研究歷史中的里程碑事件。

接下來近二十年，研究者不斷從不同的組織或細(xì)胞中培養(yǎng)出腦、腸道、視網(wǎng)膜、腎等類器官，應(yīng)用于各種領(lǐng)域。

三、 類器官的3D培養(yǎng)系統(tǒng)

3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是類器官產(chǎn)生的基礎(chǔ)，它通過懸浮培養(yǎng)建立，使用支架或無支架技術(shù)以避免細(xì)胞與塑料盤的直接物理接觸。

其中，支架是類似于天然ECM的生物凝膠或合成水凝膠，最常用的Matrigel，是由Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的異質(zhì)凝膠狀蛋白質(zhì)混合物，它主要包含粘附蛋白，如膠原蛋白、巢蛋白、層粘連蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖，類似于細(xì)胞外環(huán)境，能夠為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持和ECM信號。

無支架技術(shù)則是細(xì)胞在重力和表面張力作用下懸掛在平板上的特定培養(yǎng)基液滴中培養(yǎng)的技術(shù)。此外，類器官的3D結(jié)構(gòu)也可以通過“氣液界面”建立，在這種情況下，細(xì)胞在最初浸沒在培養(yǎng)基中的成纖維細(xì)胞或基質(zhì)膠基底層上培養(yǎng)，培養(yǎng)基逐漸蒸發(fā)并將上層細(xì)胞層暴露在空氣中以允許極化和分化[1]。

相較于傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)或者昆蟲以及哺乳動物等模型，類器官模型在各方面都給予了更大的想象空間。

四、 類器官的培養(yǎng)

類器官可來源于胚胎干細(xì)胞（ESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）、成體干細(xì)胞（ASC），或者腫瘤組織。

對于ESC/iPSC衍生的類器官，ESC/iPSC在各種細(xì)胞生長因子或小分子化合物（抑制劑/激活劑）以及基質(zhì)膠和細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的逐步分化方案下，能夠按照類似于原腸胚形成和器官發(fā)生過程中的發(fā)育線索，從三個胚層生成類器官。

對于ASC來源的類器官，ASC需要從胎兒或成人組織中產(chǎn)生；獲得單個ASC或含有ASC的組織單元之后，再通過3D培養(yǎng)方案形成類器官。

對于腫瘤組織來源的類器官，腫瘤組織內(nèi)含有小部分具有干細(xì)胞活性的腫瘤細(xì)胞，通過將腫瘤來源的組織細(xì)胞或者分離出的腫瘤干細(xì)胞等進行3D培養(yǎng)，能夠衍生出腫瘤類器官（Tumoroids）。

以胃腸道類器官培養(yǎng)為例：

胃腸道類器官可以來自于ASCs（上圖左）：先從結(jié)腸鏡檢查、胃鏡檢查或手術(shù)期間收集的胃腸道活檢中分離出組織駐留干細(xì)胞，在乙二胺四乙酸（EDTA）或酶消化后，單個細(xì)胞或組織碎片（隱窩結(jié)構(gòu)或?qū)Ч芩槠┍磺度隕CM中，并用添加了不同有絲分裂原、成形素和細(xì)胞因子的組合培養(yǎng)基覆蓋，以誘導(dǎo)細(xì)胞自我更新和組織分化。

胃腸道類器官也可以來源于ESCs和iPSCs（上圖右）：首先，使用Activin A誘導(dǎo)ESCs/iPSCs向內(nèi)胚層定向分化；隨后再根據(jù)目標(biāo)類器官需求向前腸/中腸/后腸內(nèi)胚層分化；其中，前腸主要分化為胃、肝、膽或胰腺等類器官；中腸/后腸主要分化為腸道類器官，最后，這些前體球狀體可以根據(jù)不同的生長因子方案進一步進行終末分化，定向分化形成特定的組織和器官。

更多類型類器官培養(yǎng)方案，我們這里做了一個簡單整理：

腦類器官

中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源于神經(jīng)外胚層。在沒有神經(jīng)分化抑制劑（如BMP、Nodal和 Wnts）的情況下，胚胎干細(xì)胞（ESCs）培養(yǎng)中會發(fā)生自發(fā)神經(jīng)分化，這與ESCs的神經(jīng)默認(rèn)狀態(tài)一致。

在該培養(yǎng)系統(tǒng)中，從無生長因子的二維培養(yǎng)物中分離出的ESCs在96孔非粘附培養(yǎng)板中重新聚集，重新聚集體在不含或含有最少生長因子的無血清培養(yǎng)基中保存7天，之后將它們重新接種在粘附板中。當(dāng)管腔形成時，ES細(xì)胞分化并極化形成連續(xù)的神經(jīng)外胚層樣上皮細(xì)胞，隨后產(chǎn)生分層皮質(zhì)組織，其中包含皮質(zhì)祖細(xì)胞、深皮質(zhì)層神經(jīng)元、淺皮質(zhì)層神經(jīng)元和所謂的Cajal-Retzius細(xì)胞。在沒有生長因子的情況下，生成的皮層組織自發(fā)地向延髓下丘腦發(fā)展。區(qū)域特征（例如，嗅球、頭側(cè)和尾側(cè)皮質(zhì)、下擺和脈絡(luò)叢）可以通過添加特定的細(xì)胞因子（如Fgf、Wnt和BMP）進行選擇性控制[2]。

胃類器官

胃從后前腸發(fā)育而來。Wells及其同事使用激活素處理人類PSC以生成定形內(nèi)胚層。隨后添加BMP抑制劑、FGF和Wnt激活劑誘導(dǎo)細(xì)胞向前腸發(fā)展。當(dāng)使用視黃酸時，類器官向后前腸發(fā)展。最后，高濃度的EGF將它們轉(zhuǎn)化為人類胃類器官，經(jīng)歷類似于小鼠胃竇發(fā)育的分子和形態(tài)發(fā)生階段。類器官包含原始胃腺體和凹陷樣結(jié)構(gòu)域、具有Lgr5+干細(xì)胞的增殖區(qū)、粘液細(xì)胞和大量胃內(nèi)分泌細(xì)胞[3]。

肺類器官

肺起源于發(fā)育中的腹側(cè)前腸內(nèi)胚層中的Nkx2-1+祖細(xì)胞。一項初步研究證明了原始肺和甲狀腺祖細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的定向分化。Snoeck及其同事設(shè)計了一個改進的四階段50天方案：首先，Activin A誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層；隨后，通過連續(xù)抑制BMP、TGF-β和Wnt信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)前部前腸內(nèi)胚層；然后通過Wnt、BMP、FGF和RA將細(xì)胞腹側(cè)化以獲得肺和氣道祖細(xì)胞；最后，使用 Wnt、FGF、c-AMP和糖皮質(zhì)激素使上皮細(xì)胞類型（基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、Clara 細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、I 型和 II 型肺泡上皮細(xì)胞）成熟[4]。斯賓塞和他的同事們同樣從 Activin A處理的人類PSC開始，隨后添加TGFβ/BMP抑制劑、FGF4和Wnt激活劑指示細(xì)胞朝向前部前腸發(fā)育[5]。當(dāng)Hedgehog通路同時被激活時，類器官在腹側(cè)向肺發(fā)育。在嵌入Matrigel并長時間暴露于Fgf10后，出現(xiàn)了成熟的肺類器官。培養(yǎng)物可以維持幾個月，類似于近端氣道，含有基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞和Clara細(xì)胞。內(nèi)胚層氣道組織通常被平滑肌肌動蛋白 (SMA) 陽性間充質(zhì)細(xì)胞包圍。遠(yuǎn)端（肺泡）氣道的早期標(biāo)記在培養(yǎng)早期表達，但后來丟失。

小腸和結(jié)腸類器官

小腸上皮細(xì)胞的周轉(zhuǎn)時間極短，約為5天?；钴S增殖的Lgr5+腸干細(xì)胞位于隱窩基部。它們快速分裂、轉(zhuǎn)運擴增（TA）的子細(xì)胞占據(jù)了隱窩的其余部分，并在分化后移動到絨毛的側(cè)翼，最終在絨毛尖端死亡[6]。隱窩干細(xì)胞受四種信號通路的嚴(yán)格控制。Wnt構(gòu)成維持干細(xì)胞命運和驅(qū)動干細(xì)胞和TA細(xì)胞增殖的關(guān)鍵通路。Notch有助于維持增殖性干細(xì)胞和TA細(xì)胞的未分化狀態(tài)：當(dāng) Notch 信號被阻斷時，細(xì)胞會立即分化為杯狀細(xì)胞。表皮生長因子 (EGF) 信號對干細(xì)胞和TA 細(xì)胞產(chǎn)生強烈的促有絲分裂作用。最后，BMP信號在絨毛室中活躍，它們的抑制對于創(chuàng)造隱窩許可環(huán)境至關(guān)重要[7]。

將整個隱窩或單個Lgr5+干細(xì)胞懸浮在Matrigel中，并在添加了三種重組蛋白的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)：R-spondin-1（Lgr5的Wnt信號放大器和配體）、EGF和Noggin（BMP抑制劑）。對于結(jié)腸隱窩培養(yǎng)，還需要Wnt3a使腸類器官看似無限期地生長，因為結(jié)腸上皮細(xì)胞本身幾乎不產(chǎn)生Wnt。類器官嚴(yán)格地由一個簡單的高度極化的上皮組成，緊密地閉合中央腔。地窖樣結(jié)構(gòu)向外突出。細(xì)胞的基底側(cè)朝向周圍的Matrigel。腸上皮細(xì)胞刷狀邊界形成管腔表面，而帕內(nèi)特細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的分泌物則向管腔方向分泌，所有類型的上皮細(xì)胞均以正常比率呈現(xiàn)[8，9]。長期培養(yǎng)人類小腸和結(jié)腸類器官需要添加煙酰胺以及一種小分子ALK抑制劑和一種p38抑制劑。鑒于Lgr5蛋白表達極低，已經(jīng)探索了其他干細(xì)胞標(biāo)記物來啟動腸道類器官培養(yǎng)，包括CD24，EphB2和CD166+/GRP78-。

總之，腸培養(yǎng)系統(tǒng)已經(jīng)適應(yīng)于產(chǎn)生代表一系列小鼠和人體組織的外胚層、中胚層和內(nèi)胚層來源的上皮隔室的類器官?；境煞质牵阂?、一種有效的Wnt來源；二、一種有效的酪氨酸激酶受體信號激活劑，如EGF；三、抑制BMP/Tgfβ信號，以及 四、Matrigel。

前列腺類器官

假復(fù)層前列腺上皮由基底細(xì)胞和管腔細(xì)胞組成。單個人類管腔細(xì)胞和基底細(xì)胞產(chǎn)生了類器官，但管腔細(xì)胞衍生的類器官更類似于前列腺。用R-spondin/Wnt刺激對于類器官的持續(xù)生長不是必需的，但會強烈誘導(dǎo)管腔細(xì)胞，從而導(dǎo)致類器官的前列腺樣假復(fù)層結(jié)構(gòu)。長期培養(yǎng)的類器官具有遺傳穩(wěn)定性，并在重組試驗中重建前列腺[10]。Shen及其同事獨立開發(fā)了一種基于Matrigel/EGF并補充了雄激素的培養(yǎng)系統(tǒng)，并報告了非常相似的觀察結(jié)果[11]。

五、 類器官的應(yīng)用

得益于其廣泛的組織類型、長期擴展能力和生理3D結(jié)構(gòu)，類器官正在成為許多生物醫(yī)學(xué)研究中的主流細(xì)胞培養(yǎng)工具之一，也成為了許多生物學(xué)和臨床應(yīng)用的強大新技術(shù)。

目前，類器官已廣泛用于包括發(fā)育生物學(xué)、疾病建模、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)研究、宿主-微生物組相互作用、基因編輯、多組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究等方向。

六、 類器官技術(shù)的挑戰(zhàn)與展望

盡管3D類器官領(lǐng)域正在向前發(fā)展，并為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化研究提供了創(chuàng)新方法，但仍有幾個障礙需要解決。

首先，人類類器官培養(yǎng)依賴于小鼠衍生的ECM替代品，如基質(zhì)膠和基底膜提取物。由于批量生產(chǎn)，這些提取物顯示出組分的可變性，這影響了生物研究中實驗結(jié)果的可復(fù)制性。此外，由于其未知的病原體及其引發(fā)的潛在免疫反應(yīng)，它們可能阻礙直接臨床移植。這一缺點可以通過臨床級膠原培養(yǎng)來解決。生物工程策略也將為改進方法提供新的方向。

限制當(dāng)前類器官培養(yǎng)方法在未來再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用的另一個因素是這些方法無法模擬多器官病理。共培養(yǎng)方法可以部分解決這一問題。據(jù)報道，最近的一項相關(guān)嘗試涉及hPSC衍生的腸道類器官和神經(jīng)嵴細(xì)胞的組合。此外，最近的研究還設(shè)計了創(chuàng)建器官芯片技術(shù)的策略，以生成3D系統(tǒng)，實現(xiàn)多個預(yù)制“器官”之間的連接和通信。

組織成熟是限制類器官技術(shù)充分發(fā)揮臨床前甚至臨床應(yīng)用潛力的第三個關(guān)鍵因素。例如，類器官培養(yǎng)系統(tǒng)在很大程度上復(fù)制了胎兒大腦發(fā)育階段，這使得難以對影響成人大腦的神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行建模，例如阿爾茨海默病。為了克服這些障礙，已經(jīng)優(yōu)化了許多方案，包括用小分子化合物（如BDNF261）預(yù)處理類器官，以加速成熟。氧合和營養(yǎng)擴散是成熟過程中的另外兩個關(guān)鍵因素。類器官的長期培養(yǎng)不會隨著時間的推移而擴大，而是由于缺氧導(dǎo)致類器官的核心立即發(fā)生凋亡/壞死，形成空腔。這在大腦類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中相對頻繁地觀察到。為了解決這個問題，類器官最初是在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器中或使用搖床生長的。其他的嘗試是設(shè)計各種的血管化技術(shù)策略。例如，全腦類器官已重新嵌入含有iPSC衍生內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)凝膠中，以形成血管化的類器官，這進一步促進類器官的生長并提供營養(yǎng)；此外，生物材料、納米技術(shù)、生物工程和其他先進方案的結(jié)合可能會使人類類器官在未來得以擴大和長期培養(yǎng)。

另一個令人困惑的問題是，有限的再現(xiàn)性是產(chǎn)生更高級別類器官和控制其功能的主要障礙。影響類器官再現(xiàn)性的基本因素基本上包括批間變異、類器官生產(chǎn)可擴展性、細(xì)胞組成和類器官結(jié)構(gòu)。Krefft及其團隊已經(jīng)建立了一種前腦類器官方法，該方法通過基于iPSC的自組織能力添加模式因子來減少異質(zhì)性。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，可以預(yù)見的是，一個相對準(zhǔn)確、可復(fù)制的3D模型可能會出現(xiàn)，實現(xiàn)類器官技術(shù)從科學(xué)研究到臨床實踐的轉(zhuǎn)變，并加速更大規(guī)模的類器官制造用于藥物篩選。

值得注意的是，與PSC衍生類器官不同，AdSC衍生類器官僅代表器官的上皮部分，因此總結(jié)了原始上皮的典型結(jié)構(gòu)和功能；相比之下，基質(zhì)、神經(jīng)、免疫細(xì)胞和脈管系統(tǒng)的隔室是缺失的。因此，ASC衍生的類器官顯示出比PSC衍生的器官更低的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，但更接近成人組織。

總體而言，新興的類器官技術(shù)已經(jīng)對生物醫(yī)學(xué)研究、個體化醫(yī)學(xué)中的藥物篩選以及與基因組編輯技術(shù)相結(jié)合的基因治療有用。類器官的廣泛應(yīng)用尚處于探索的初期階段。廣泛的研究將使3D類器官系統(tǒng)能夠補充現(xiàn)有的模型系統(tǒng)，這將在未來加強基礎(chǔ)和臨床研究。

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