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二、實(shí)驗(yàn)材料

l?主要試劑

l?主要儀器及器材

三、?實(shí)驗(yàn)方法?

1、?捕獲蛋白制備

1）?收集的細(xì)胞中加入1mL 預(yù)冷的PBS;?吹打混勻后，1500g 離心 5 min，去除上清，再重復(fù)洗滌細(xì)胞 1 次;

2）?加入800ul cell lysis buffer(預(yù)先加入Protease inhibitor及PMSF)

3）?17000g，4℃離心10min；轉(zhuǎn)移上清到一個新的1.5mL離心管中；

4）?取30ul上清樣本作為input,-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

5）?剩余樣本用于后續(xù)pull down 實(shí)驗(yàn)。

注：如果需要驗(yàn)證兩個蛋白是否直接互作，則需要過表達(dá)并純化捕獲蛋白。

2、?誘餌蛋白制備

1）?取誘導(dǎo)成功的 GST-誘餌蛋白表達(dá)大腸桿菌菌液（GST-P53）?5?mL，4000 g離心 10 min，去除上清培養(yǎng)基；

2）?加入5?mL?PBS吹打混勻后，1500g 離心 5 min，去除上清；

3）?加入1?mL PBS并加入10 ul?Protease inhibitor 和 10 ul?PMSF，吹打混勻；

4）?在超聲波破碎儀上冰浴超聲樣品至溶液透亮；

5）?4℃，17000g 離心超聲破碎樣品 10min，轉(zhuǎn)移上清到1.5?mL離心管中

3、?磁珠準(zhǔn)備

1）?將GSH 磁珠顛倒混勻后，分別取 50 ul?GSH 磁珠到1.5ml離心管中，將離心管置于磁力架上靜置3min;待澄清后棄上清；

2）?加人 500μL?Wash buffer，顛倒混勻，置于磁力架上靜置3min，待澄清后棄上清，重復(fù)洗滌1 次；

3）?加50 ul?Wash buffer重懸磁珠

4、?誘餌蛋白與磁珠結(jié)合

1）?分別取500ul新鮮制備的誘餌融合蛋白GST-P53及GST蛋白，加入到準(zhǔn)備好的 50 ul?GSH 磁珠懸液中；

2）?4℃，垂直混勻器上搖動孵育 30min；

3）?置于磁力架上靜置3min，待澄清后棄上清；

4）?加入預(yù)冷的500μL Wash buffer， 4℃垂直混勻器上搖動 5min洗滌，置于磁力架上靜置3min，待澄清后棄上清；

5）?重復(fù)上上步驟2次，即共洗滌3次；

5、?GST-pulldown

1）?分別向步驟 4獲得的GST-P53及GST管中加入300μL捕獲蛋白裂解液；

2）?4℃，垂直混勻器上翻轉(zhuǎn)孵育過夜；

3）?置于磁力架上靜置3min，待澄清后棄上清；

4）?磁珠加入預(yù)冷的500μL?Wash buffer，隨后 4℃顛倒混勻5min，置于磁力架上靜置3min，待澄清后棄上清；

5）?重復(fù)上步驟4次，即共洗滌5次。

6）?分別加入 50μL Elution buffer，沸水浴變性洗脫 10min；

7）?磁力架靜置吸附磁珠，收集上清-80℃保存；

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6、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1）固定：電泳結(jié)束后，取凝膠放入約100ml固定液（配方見表2）中，在搖床上室溫?fù)u動20分鐘，搖動速度為60-70rpm。

表2 固定液配置

2） 30%乙醇洗滌：棄固定液，加入100ml 30%乙醇，在搖床上室溫?fù)u動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

3）水洗滌：棄30%乙醇，加入200ml雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

4）增敏：棄水，加入100ml銀染增敏液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動2分鐘，搖動速度為60-70rpm。

5）水洗滌(共2次)：棄原有溶液，加入200ml雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。

6）重復(fù)步驟5

7）銀染：棄水，加入100ml銀溶液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

8）水洗滌：棄原有溶液，加入100ml雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動1-1.5分鐘，搖動速度為60-70rpm。

9）顯色：棄水，加入100ml銀染顯色液，在搖床上室溫?fù)u動3-10分鐘，直至出現(xiàn)比較理想的預(yù)期蛋白條帶，搖動速度為60-70rpm。

10）終止：棄銀染顯色液，加入100ml銀染終止液(1X)，在搖床上室溫?fù)u動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

11）水洗滌：棄銀染終止液，加入100ml雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動2-5分鐘，搖動速度為60-70rpm。在雙蒸水中保存或制成干膠。

1、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

a.銀染結(jié)果：

b.WB檢測結(jié)果：

7、項(xiàng)目內(nèi)容

廣州如期生物技術(shù)有限公司成立于2016年，始終以探索科學(xué)、服務(wù)客戶為己任；致力于為高校、科研院所、醫(yī)院、制藥企業(yè)提供全面、便捷、專業(yè)的技術(shù)服務(wù)和產(chǎn)品。技術(shù)方面我們專注于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：公司擁有完善的技術(shù)服務(wù)平臺，覆蓋分子生物學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)，表觀遺傳等多個科研平臺。在產(chǎn)品方面，自主研究多種類型科研試劑盒20多項(xiàng)，如：COIP、CHIP、RIP等科研檢測試劑盒，較之同類型的進(jìn)口試劑盒，極大的降低了科研成本。

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