熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)是基于蛋白質(zhì)在受熱時變性溶解度降低的原理。蛋白質(zhì)可以在與小分子(如藥物或代謝物)、核酸或其他蛋白質(zhì)相互作用時或在翻譯后修飾時改變其熱穩(wěn)定性。TPP使用基于多重定量質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)來監(jiān)測數(shù)千種表達蛋白質(zhì)的熔解曲線。重要的是，這種方法可以在體外或在體內(nèi)進行。它已被成功地應(yīng)用于識別藥物的靶標(biāo)和非靶標(biāo)，或研究蛋白質(zhì)-代謝物和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。因此，TPP為蛋白質(zhì)在原生環(huán)境和蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)狀態(tài)和相互作用提供了獨特的見解，使我們能夠研究基本的生物學(xué)過程及其潛在的機制。接下來介紹一篇TPP的應(yīng)用案例。

寄生蟲(線蟲)會導(dǎo)致破壞性疾病，給世界各地的人類和其他動物帶來巨大的痛苦。這些寄生蟲的控制在很大程度上依賴驅(qū)蟲療法，但治療失敗和對這些藥物的耐藥性普遍存在。由于開發(fā)針對寄生線蟲的疫苗在很大程度上沒有成功，人們越來越重視發(fā)現(xiàn)新的驅(qū)蟲方法來對抗抗藥性蠕蟲。2022年10月14日，F(xiàn)rontiers in Pharmacology雜志(IF:5.988)上在線發(fā)表了題為“Thermal proteome profiling reveals Haemonchus orphan protein HCO_011565 as a target of the nematocidal small molecule UMW-868”的研究論文。該研究采用熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)來探索HIT藥理學(xué)。利用先進的結(jié)構(gòu)預(yù)測和對接工具，推斷出驅(qū)蟲小分子（HIT化合物：UMW-868）在高致病性捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）和其他具有重要社會經(jīng)濟意義的寄生線蟲中的全新寄生蟲特異性靶標(biāo)(HCO_011565)。

實驗設(shè)計

經(jīng)UMW-868處理的H.?Contortus?xL3s和對照組H.?Contortus?xL3s；分別在10個溫度梯度處理下的TPP熱蛋白組研究。

研究思路

研究結(jié)果

UMW-868在H. contortus中引起主要細(xì)胞死亡，而對哺乳動物肝細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性或有絲分裂毒性

作者測量了經(jīng)UMW-868處理的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲xL3s的細(xì)胞死亡。暴露90小時后，在UMW-868-處理的xL3s（>5μM）中檢測到細(xì)胞死亡，而用非活性類似物（A-3155）處理的xL3s仍然存活（圖1A）。在50μM時，UMW-868可100%殺死處理過的xL3s，其IC50值為34.8uM(圖1B)。暴露于UMW-868 168h后，幼蟲全身可見死亡細(xì)胞(圖1C)，而暴露于A-3155或DMSO的xL3s則未檢測到死亡細(xì)胞(圖1C)。接下來測試了UMW-868對HepG2細(xì)胞和線粒體的毒性；UMW-868在高達100μM的濃度下沒有表現(xiàn)出任何明顯的細(xì)胞毒性或有絲分裂毒性(圖1D)。

孤兒蛋白HCO_011565是UMW-868靶標(biāo)的證據(jù)

前期實驗證明了UMW-868具有驅(qū)蟲活性，并且對哺乳動物肝細(xì)胞沒有細(xì)胞或線粒體毒性，接下來的目標(biāo)是確定該化合物的作用靶點。利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)(TPP)，共鑒定和定量了3,678個蛋白。通過非參數(shù)響應(yīng)曲線分析(NPARC)評估定量蛋白質(zhì)的熱熔曲線，將非參數(shù)模型與溫度曲線數(shù)據(jù)擬合后，得到了2,591條不同的熔解曲線圖譜。經(jīng)過篩選共鑒定了55種蛋白質(zhì)，它們的熱穩(wěn)定性和豐度在UMW-868存在的情況下發(fā)生了變化。在這55種蛋白質(zhì)中，兩種未表征的蛋白質(zhì)(分別由基因HCO_011565和HCO_014287編碼),在UMW-868存在下表現(xiàn)出最高的熱穩(wěn)定性(圖2)，這表明它們是UMW-868的作用靶標(biāo)。

隨后，作者研究了這兩個分子的轉(zhuǎn)錄表達水平。研究發(fā)現(xiàn)HCO_011565在H. contortus的所有關(guān)鍵發(fā)育階段都有轉(zhuǎn)錄表達，在卵、L3、L4(四齡幼蟲)和成蟲階段都有高表達。對于HCO_014287，僅在L2和L3階段記錄到中到高的轉(zhuǎn)錄水平，但在其他發(fā)育階段表達有限或沒有表達(圖3B)。基于這些發(fā)現(xiàn)，選擇了HCO_011565作為進一步的研究對象。

藥物化學(xué)導(dǎo)致H. contortus的效力增強

接下來作者探究了改變其（UMW-868）化學(xué)結(jié)構(gòu)以嘗試增強效力。在UMW-868的“南部區(qū)域”，用噻吩取代芳基環(huán)不會改變xL3s運動效力（A-3126；IC50 12.1 μM）。然而，效力隨著向芳基中添加4-甲基（A3136；IC50 4.8 μM）而增加，并隨著4-三氟甲基取代（A-6501；IC50 1.6 μM）而進一步增強。在“北部區(qū)域”（R2），用乙氧基取代正丙基提高了效力（A-3134；IC50 7.8 μM），并通過引入4-二氟甲氧基進一步增強了效力（A- 4340；IC50 4.0 μM）。根據(jù)xL3s活力降低的結(jié)果，其中一些修飾類似物（即?A-3136、A-6318、A-6501和?A-4340）增強了對幼蟲發(fā)育的抑制效力。

總結(jié)

該研究基于高通量表型篩選，確定了一種候選驅(qū)蟲藥物?(UMW-868)，它對H. contortus和至少三種其他線蟲物種具有可重復(fù)且非常有效的殺蟲活性。使用熱蛋白質(zhì)組學(xué)分析(TPP)，在H. contortus中發(fā)現(xiàn)了一個新的蛋白質(zhì)靶標(biāo)（命名為?HCO_011565），它與UMW-868具有相互作用。該研究建立的工作流程：將體外篩選、效力評估和TPP指導(dǎo)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)識別與計算機結(jié)構(gòu)預(yù)測和配體對接相結(jié)合，可能是一種有用的工具，可支持發(fā)現(xiàn)新型驅(qū)蟲藥和匹配目標(biāo)候選物以進行優(yōu)先排序和后續(xù)評估。鑒于世界范圍內(nèi)具有重要農(nóng)業(yè)和獸醫(yī)意義的線蟲普遍存在驅(qū)蟲藥耐藥性問題，這具有重大意義。

會議信息

BPCF2023第四屆中國（北京）生物藥工藝高峰論壇四月與您相約北京！

主辦單位：生物藥資訊

會議主題：BPCF2023第四屆中國（北京）生物藥工藝高峰論壇

會議時間：2023年04月03-04號

會議地點：北京朗麗茲西山花園酒店