寫在前面

????????今天推薦的是由天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)部在2020年8月29日發(fā)表于Theranostics（IF：11.556，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Lei Shi教授，研究表明由ECT2和USP7形成的前饋調(diào)節(jié)回路有助于乳腺癌發(fā)生。

研究背景

????????包括上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子ECT2在內(nèi)的一些鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEFs）被認(rèn)為是通過激活不同的致癌GTP酶來驅(qū)動(dòng)致癌的。然而，ECT2不依賴GEF的功能是否也在腫瘤發(fā)生中起作用仍不清楚。

摘要部分

????????ECT2在乳腺癌中起著促進(jìn)腫瘤的作用，GEF活性缺陷的ECT2能夠緩解ECT2耗竭帶來的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷。作者證明了ECT2與泛素特異性蛋白酶USP7的物理相互作用，并以獨(dú)立于GEF活性的方式在功能上促進(jìn)USP7的分子間自結(jié)合、去泛素化和穩(wěn)定化。反過來，USP7去泛素化并穩(wěn)定ECT2，形成一個(gè)前饋調(diào)節(jié)回路，最終維持致癌蛋白MDM2的表達(dá)。作者的研究發(fā)現(xiàn)了ECT2在促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生存中的GEF獨(dú)立作用，為ECT2和USP7的相互調(diào)節(jié)提供了分子見解，并支持將ECT2/USP7作為乳腺癌干預(yù)的潛在目標(biāo)。

研究?jī)?nèi)容

1.ECT2 在乳腺癌發(fā)生中的GEF獨(dú)立作用??? ? ?

????????作者首先通過Oncomine進(jìn)行疾病分析發(fā)現(xiàn)，ECT2在不同組織學(xué)的乳腺癌樣本中高度表達(dá)，表明ECT2與乳腺癌有關(guān)。為了證實(shí)ECT2參與乳腺癌的發(fā)生，作者通過免疫組織化學(xué)（IHC）染色發(fā)現(xiàn)ECT2在乳腺癌中高度表達(dá)，且ECT2的表達(dá)水平與腫瘤等級(jí)基本相關(guān)。? ? ?

????????作者接下來分析了ECT2的表達(dá)及其與乳腺癌患者臨床行為的相關(guān)性。來自GEO數(shù)據(jù)集的Kaplan-Meier生存分析表明，ECT2表達(dá)的升高預(yù)示著乳腺癌患者的總生存率（OS）、無(wú)復(fù)發(fā)生存率（RFS）、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率（DMFS）和進(jìn)展后生存率（PPS）都很差。這些發(fā)現(xiàn)共同表明ECT2在乳腺癌中具有促進(jìn)腫瘤的作用。? ? ?

????????為了研究ECT2在乳腺癌發(fā)生中的作用，作者首先分析了ECT2敲低對(duì)乳腺癌細(xì)胞生存的影響。群落形成實(shí)驗(yàn)顯示，敲除ECT2嚴(yán)重阻礙了乳腺癌細(xì)胞的群落大小和數(shù)量。為了研究ECT2的GEF活性是否對(duì)腫瘤的生存至關(guān)重要，作者通過shRNA敲低處理及群落形成實(shí)驗(yàn)表明，ECT2/GEFmt（GEF活性缺陷的ECT2突變體）可以抵消ECT2敲低所引起的生長(zhǎng)缺陷。?

研究結(jié)論：ECT2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，且不依賴于GEF。

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2.ECT2與泛素特異性蛋白酶USP7有相互作用? ???

????????FLAG-ECT2 的蛋白質(zhì)復(fù)合物的質(zhì)譜分析表明，ECT2 與多種蛋白質(zhì)相關(guān)，包括 USP7。為了證實(shí)ECT2與USP7的體內(nèi)關(guān)聯(lián)，使用來自 MCF-7 細(xì)胞的細(xì)胞提取物進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證明ECT2與USP7免疫共沉淀。另一方面，作者還發(fā)現(xiàn)USP7可以與 ECT2/GEFmt免疫共沉淀，并且該突變體對(duì)USP7表現(xiàn)出與野生型ECT2(ECT2/wt) 相似的結(jié)合親和力。

????????接下來，作者使用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡分析顯示ECT2與USP7共定位。此外，作者使用 LacO-LacI 靶向系統(tǒng)測(cè)試了USP7是否與ECT2共定位，作者觀察到內(nèi)源性USP7形成與 ECT2-mCherry-LacI 共定位的明顯病灶，而USP7在表達(dá) mCherry-LacI 的細(xì)胞中沒有形成病灶。此外，對(duì)來自不同細(xì)胞區(qū)室的蛋白質(zhì)分級(jí)進(jìn)行的免疫共沉淀分析表明，USP7可以與細(xì)胞核ECT2共免疫沉淀，但不能與細(xì)胞溶質(zhì) ECT2共沉淀。

研究結(jié)論：核ECT2與USP7發(fā)生直接相互作用，并且ECT2在該蛋白質(zhì)復(fù)合物中的分子行為可能與典型的GEF-GTPase信號(hào)無(wú)關(guān)。

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3.ECT2抑制USP7多泛素化并促進(jìn)其穩(wěn)定? ? ?

????????作者接下來探究ECT2是否可以變構(gòu)增強(qiáng)USP7的去泛素化酶活性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，在ECT2存在與否的情況下，使用 K48 或 K63 連接的泛素連接和表達(dá)USP7的細(xì)胞進(jìn)行了體外去泛素化分析。結(jié)果表明，重組USP7能夠切割泛素鏈，而添加ECT2對(duì)USP7催化的泛素鏈切割的影響很小。盡管ECT2未能激活USP7的酶活性，但作者發(fā)現(xiàn)ECT2敲低導(dǎo)致幾種USP7底物在蛋白質(zhì)水平上顯著下調(diào)，但在 mRNA 水平上沒有。另一方面，作者發(fā)現(xiàn)ECT2缺陷的幾種細(xì)胞中USP7的蛋白質(zhì)水平顯著降低，而USP7mRNA 水平基本不變。? ? ?

????????接下來，用 FLAG-ECT2 和靶向ECT2的 siRNA 轉(zhuǎn)染 MCF-7 細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡分析顯示ECT2表達(dá)的增加能夠恢復(fù)USP7在ECT2缺陷細(xì)胞中的表達(dá)。接下來，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體特異性抑制劑 MG132 的添加有效地阻止了與ECT2敲低相關(guān)的USP7的減少，表明這種作用可能是通過蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解機(jī)制。

????????為了測(cè)試ECT2促進(jìn)的USP7穩(wěn)定是否是通過對(duì)抗泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體降解，作者檢查了ECT2是否具有拮抗USP7泛素化的功能。對(duì)構(gòu)建的不同細(xì)胞進(jìn)行裂解并進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ECT2的敲低導(dǎo)致泛素化USP7水平的增加。免疫沉淀分析顯示泛素化 Myc-USP7蛋白的水平在ECT2高表達(dá)細(xì)胞中明顯降低。作者同時(shí)也證明內(nèi)源性USP7的泛素化水平在ECT2缺陷細(xì)胞中升高，而在ECT2過表達(dá)細(xì)胞中降低。

研究結(jié)論：ECT2通過抑制其多泛素化功能控制USP7的蛋白穩(wěn)定性，并且細(xì)胞核GEF/GTPase信號(hào)不參與這個(gè)過程。

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4.ECT2 促進(jìn)USP7分子間自締合、去泛素化和穩(wěn)定化? ? ?

????????作者認(rèn)為ECT2促進(jìn)的USP7穩(wěn)定可能是通過增強(qiáng)USP7與其他去泛素化酶的關(guān)聯(lián)或保護(hù)它免受 E3 連接酶的泛素化。作者研究ECT2 是否在此過程中起作用。作者首先驗(yàn)證了USP7能夠與自身相互作用，表現(xiàn)為 Myc-USP7可以被 FLAG-USP7有效地免疫沉淀）。蛋白質(zhì)印跡分析表明，在 GFP-USP7/wt 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)USP-7的表達(dá)量提高，而內(nèi)源性USP7的 mRNA 表達(dá)未通過 qRT-PCR 檢測(cè)而改變。這些結(jié)果表明USP7與自身相互作用并使其自身穩(wěn)定。接下來，作者檢查了USP7是否控制其自身的泛素化。USP7/wt 的表達(dá)顯著降低了泛素化USP7/C223S 物種的水平。因此，USP7可能會(huì)從自身去除多聚泛素綴合物以保持其蛋白質(zhì)豐度。

????????為了研究ECT2在USP7自我調(diào)節(jié)中的作用，作者首先將對(duì)照 siRNA 或ECT2siRNA 轉(zhuǎn)染到表達(dá) GFP-USP7和 mCherry-LacI-USP7的 LacO 細(xì)胞中。共聚焦顯微鏡分析表明ECT2敲低極大減少了 GFP-USP7和 mCherry-LacI-USP7的共定位。此外，作者發(fā)現(xiàn)ECT2過表達(dá)促進(jìn)了這種效果。結(jié)果表明ECT2在促進(jìn)USP7自關(guān)聯(lián)方面發(fā)揮著重要作用。與體內(nèi)去泛素化試驗(yàn)的結(jié)果一致，使用 Sf9 細(xì)胞純化的USP7和 His-Ub 偶聯(lián)的USP7/C223S 的體外去泛素化試驗(yàn)表明ECT2添加顯著促進(jìn)USP7自去泛素化。另一方面作者發(fā)現(xiàn)ECT2敲低削弱了由 GFP-USP7的強(qiáng)制表達(dá)誘導(dǎo)的內(nèi)源性USP7的上調(diào)。

研究結(jié)論：ECT2可以促進(jìn)USP7分子間自締合、去泛素化和穩(wěn)定化，并且這些作用與ECT2 GEF活性無(wú)關(guān)。

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5.USP7穩(wěn)定ECT2? ? ??

????????為了進(jìn)一步探究USP7和ECT2之間物理相互作用的功能意義，作者檢查了USP7對(duì)ECT2表達(dá)的影響。在USP7敲低的 MCF-7 細(xì)胞和 MDA-MB-468 細(xì)胞中ECT2的水平顯著降低，而ECT2的 mRNA 表達(dá)水平不受USP7敲低的影響。為了進(jìn)一步支持這一推論，通過放線菌酮 (CHX) 追蹤分析評(píng)估了USP7調(diào)節(jié)ECT2蛋白穩(wěn)態(tài)水平的潛力。蛋白質(zhì)印跡分析顯示USP7敲低明顯與ECT2的半衰期縮短有關(guān)。這些觀察結(jié)果表明ECT2是USP7的潛在底物。為了獲得對(duì)USP7和ECT2之間功能聯(lián)系的分子機(jī)制，作者探究了USP7促進(jìn)的ECT2穩(wěn)定性是否取決于其泛素特異性蛋白酶活性。用USP7的抑制劑導(dǎo)致ECT2的蛋白質(zhì)水平呈劑量依賴性降低，而對(duì)其mRNA 水平?jīng)]有影響。此外，USP7敲除細(xì)胞中ECT2的下調(diào)可以通過USP7/wt 的強(qiáng)制表達(dá)完全恢復(fù)。這些結(jié)果支持USP7通過USP7去泛素化酶活性調(diào)節(jié)ECT2穩(wěn)定性的論點(diǎn)。

????????鑒于ECT2是一種泛素化蛋白并且USP7促進(jìn)了ECT2的穩(wěn)定化，作者接下來探究USP7是否具有去泛素化ECT2的功能。首先，作者表明USP7的敲低導(dǎo)致泛素化ECT2物種水平的增加。然后，作者發(fā)現(xiàn)USP7過表達(dá)與泛素化ECT2物種水平降低有關(guān)。與USP7的酶抑制導(dǎo)致ECT2不穩(wěn)定的觀察結(jié)果一致，用USP7抑制劑 GNE-6640 處理 HeLa 細(xì)胞 4 小時(shí)導(dǎo)致泛素化ECT2物種水平顯著增加和總ECT2減少。接下來，作者通過體外去泛素化分析表明，USP7/wt 能夠去泛素化 ECT2，而USP7/ C223S 不行。這些結(jié)果表明USP7靶向ECT2進(jìn)行去泛素化，表明ECT2是USP7的真正底物。

研究結(jié)論：ECT2和USP7在控制彼此穩(wěn)定方面形成正反饋調(diào)節(jié)回路。

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6.MDM2是ECT2/USP7回路的關(guān)鍵下游效應(yīng)器? ???

????????作者采用RNA-seq 來表征可能有助于ECT2促進(jìn)乳腺癌發(fā)生的候選效應(yīng)子或效應(yīng)子相關(guān)信號(hào)通路。作者鑒定了 365 個(gè)在ECT2和USP7耗盡細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生改變的基因，發(fā)現(xiàn)幾乎所有這些基因都聚集為由ECT2和USP7以相同方向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶標(biāo)，支持了ECT2和USP7的功能與彼此相互作用。由ECT2和USP7共同調(diào)節(jié)的基因隨后被分類為各種信號(hào)通路。? ? ?

????????作者接下來選擇了幾個(gè)代表性基因并通過 qRT-PCR 驗(yàn)證了它們?cè)?MCF-7 細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，在敲低ECT2或USP7后，MDM2、p21、PUMA、TP53INP1、TP53INP2、GDF15 和 IGFBP3 的 mRNA 水平升高，盡管程度不同，而 TP53 的表達(dá)沒有變化。這些結(jié)果表明 p53 信號(hào)通路在ECT2或USP7缺陷細(xì)胞中被激活。作者接下來想知道 p53 是否是 ECT2/USP7調(diào)節(jié)下游效應(yīng)所必需的。作者通過敲除P53并重新表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ECT2敲低相關(guān)的MDM2不穩(wěn)定可以通過USP7在這些細(xì)胞的每種類型中的重新表達(dá)來恢復(fù)。與USP7減少相關(guān)的ECT2缺陷在很大程度上被USP7的重新表達(dá)所回補(bǔ)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明ECT2在MDM2穩(wěn)定中的參與取決于USP7，并支持 ECT2/USP7前饋調(diào)節(jié)回路在促進(jìn) p53 熟練和 p53 缺陷細(xì)胞中MDM2穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的觀點(diǎn)。

????????為了進(jìn)一步研究該電路的生物學(xué)意義，進(jìn)行了群落形成試驗(yàn)。結(jié)果表明，ECT2缺失相關(guān)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)遲緩可以在一定程度上通過強(qiáng)制表達(dá)MDM2或USP7/wt逆轉(zhuǎn)。然后，作者檢查了MDM2和USP7在 MDA-MB-468 異種移植腫瘤樣品中的表達(dá)。結(jié)果表明ECT2敲低與MDM2和USP7的下調(diào)有關(guān)。為了將作者的觀察擴(kuò)展到臨床病理學(xué)相關(guān)的背景，作者隨后分析了 ECT2、USP7和MDM2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與乳腺癌樣本和組織學(xué)上正常的乳腺組織。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)根據(jù)免疫陽(yáng)性的平均強(qiáng)度程度對(duì)染色進(jìn)行分析時(shí)，ECT2 和USP7連同MDM2在乳腺癌樣本中高度表達(dá)，并且它們的表達(dá)水平彼此相關(guān)。

研究結(jié)論：ECT2/USP7回路可能與乳腺癌發(fā)生有關(guān)，并且ECT2與USP7協(xié)調(diào)以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞存活。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者揭示了ECT2在促進(jìn)乳腺癌發(fā)生中以GEF活性非依賴的方式發(fā)揮作用。具體來說，作者發(fā)現(xiàn)ECT2和USP7形成一個(gè)正反饋回路，其中ECT2促進(jìn)USP7分子間自締合、去泛素化和穩(wěn)定化，反過來，USP7去泛素化和穩(wěn)定ECT2。該回路最終通過維持致癌蛋白MDM2的表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活。

Thank you!

原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7482815/