本期特邀文章第一作者邵嘉皓博士分享解讀，感謝四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院賴松家教授團(tuán)隊(duì)對(duì)circRNA平臺(tái)的關(guān)注！

白色脂肪組織是一個(gè)支持甘油三酯代謝、炎癥細(xì)胞因子和脂肪因子釋放的多功能器官。白色脂肪細(xì)胞具有協(xié)調(diào)整合全身代謝變化以維持代謝穩(wěn)態(tài)的能力。當(dāng)慢性營(yíng)養(yǎng)攝入過多時(shí)，脂質(zhì)沉積加劇，影響脂肪和其他器官的內(nèi)部微環(huán)境，并進(jìn)一步影響機(jī)體健康。

circRNA和miRNA是調(diào)控脂質(zhì)代謝重編程的重要分子。其中，circRNA作為一種非線性RNA，通過蛋白質(zhì)海綿、miRNA海綿，甚至編碼功能發(fā)揮作用。miRNA是一種小RNA分子，通過與3′-UTR配對(duì)來指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄后抑制。研究表明，肥胖期間，circRNA和miRNA在脂肪細(xì)胞或肝組織中的表達(dá)模式發(fā)生改變。在功能上，circSAMD4A和circTshz2-1促進(jìn)脂肪形成，而circPTK2加速脂肪組織中的脂肪分解。在肝細(xì)胞中，circRNA_0000660沉默促進(jìn)脂質(zhì)沉積，而circScd1過表達(dá)則抑制脂滴的合成。

綜上，circRNA和miRNA因其在脂質(zhì)代謝和疾病中的作用而引起了人們的廣泛關(guān)注。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了脂肪細(xì)胞或肝細(xì)胞中脂質(zhì)積累的主要途徑，但在肥胖的背景下，circRNA和miRNA的許多功能仍有待進(jìn)一步探索。

2023年8月17日，《Cellular and Molecular Life Sciences》（IF=8.0）發(fā)表了四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院賴松家教授團(tuán)隊(duì)的研究論文，題為“Interference of a mammalian circRNA regulates lipid metabolism reprogramming by targeting miR-24-3p/lgf2/Pl3K-AKT-mTOR and lgf2bp2/Ucp1 axis”。該研究報(bào)道了一種在肥胖動(dòng)物個(gè)體中異常高表達(dá)的circRNA，即mmu_circ_0001874。機(jī)制上，mmu_circ_0001874海綿吸附miR?24?3p，靶向調(diào)節(jié)Igf2，進(jìn)而影響下游PI3K?AKT?mTOR信號(hào)通路。此外，mmu_circ_0001874通過RNA結(jié)合蛋白Igf2bp2促進(jìn)Ucp1表達(dá)。該研究強(qiáng)調(diào)了circRNA在脂質(zhì)代謝重編程中的作用，并提示mmu_circ_0001874/miR-24-3p/lgf2/PI3K-AKT-mTOR和mmu_circ_0001874/Igf2bp2/Ucp1軸可能是調(diào)控動(dòng)物脂質(zhì)沉積的潛在機(jī)制。

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院邵嘉皓博士為第一作者，賴松家教授為本文通訊作者。

結(jié)果1?miR-24-3p與脂質(zhì)代謝相關(guān)

使用團(tuán)隊(duì)前期的研究材料，作者發(fā)現(xiàn)miR?24?3p在肥胖家兔的脂肪和肝臟組織中表達(dá)下調(diào)（圖1A）。其中，脂肪組織miR?24?3p表達(dá)與血清瘦素水平負(fù)相關(guān)，而與脂聯(lián)素正相關(guān)（圖1B）。在肝臟組織中，miR?24?3p表達(dá)與肝臟甘油三酯水平負(fù)相關(guān)（圖1C）。通過細(xì)胞培養(yǎng)，作者發(fā)現(xiàn)miR?24?3p在前體脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟脂肪的過程與棕櫚酸處理的成熟脂肪細(xì)胞中下調(diào)（圖1D-F）。此外，KEGG分析揭示前5的靶基因集顯著富集于癌癥、PI3K-AKT信號(hào)通路、內(nèi)吞作用、MAPK信號(hào)通路、以及Ras信號(hào)通路（圖1G）。

結(jié)果2?miR-24-3p調(diào)節(jié)前體脂肪細(xì)胞增殖與分化

在細(xì)胞水平，作者使用miR?24?3p mimic和inhibitor來研究miR?24?3p對(duì)前體脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響。在細(xì)胞增殖的背景下，轉(zhuǎn)染效率被測(cè)定（圖2A）。同時(shí)，miR-24-3p mimic處理顯著抑制前體脂肪細(xì)胞增殖，而這一結(jié)果在miR-24-3p inhibitor組則反之（圖2B-F）。對(duì)于細(xì)胞分化，作者測(cè)定了miR-24-3p mimic和inhibitor的轉(zhuǎn)染效率以確定轉(zhuǎn)染的有效性（圖2G）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，miR-24-3p mimic抑制了細(xì)胞內(nèi)分化標(biāo)志基因PPARG、CEBPA、FABP4的表達(dá)，而miR-24-3p inhibitor促進(jìn)其表達(dá)（圖2H-K）。

結(jié)果3?體內(nèi)過表達(dá)miR-24-3p抵抗高脂飲食介導(dǎo)的肥胖

接下來，作者進(jìn)一步研究了miR-24-3p在動(dòng)物體內(nèi)參與脂質(zhì)代謝的作用。通過尾靜脈注射miR-24-3p體內(nèi)激動(dòng)劑同時(shí)飼喂高脂飲食建立動(dòng)物模型（圖3A）。結(jié)果顯示，在高脂飲食的背景下，miR-24-3p過表達(dá)抑制了動(dòng)物的體重增長(zhǎng)（圖3B），血脂（圖3C），脂肪和肝臟重量（圖3D），脂肪細(xì)胞橫切面積（圖3E），組織炎癥因子（圖3F），肝臟甘油三酯含量（圖3G），改善了GTT（圖3H）和ITT（圖3I）。在脂肪和肝臟組織中，熒光定量和免疫印跡實(shí)驗(yàn)揭示miR-24-3p過表達(dá)抑制了脂代謝相關(guān)因子和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)（圖3J-O）。

結(jié)果4?作為miR-24-3p的靶基因，Igf2通過PI3K-AKT-mTOR通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)生成

作者通過測(cè)序獲得了脂肪中的mRNA表達(dá)變化（圖4A-4B）。KEGG-GSEA分析揭示PI3K-AKT和mTOR通路在組間富集（圖4C）。其中，Igf2由于其與脂肪生理、脂質(zhì)代謝、肥胖等相關(guān)，進(jìn)而被選為關(guān)鍵基因用于進(jìn)一步研究。RNA22網(wǎng)站分析miR-24-3p和Igf2之間的結(jié)合位點(diǎn)，再通過定量驗(yàn)證Igf2在miR-24-3p過表達(dá)動(dòng)物中的表達(dá)（圖4D-E）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者之間的結(jié)合（圖4F）。接下來，篩選出高效率的siRNA和過表達(dá)載體（圖4G-H）Igf2干擾抑制脂代謝和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)而Igf2過表達(dá)則反之（圖4I-N）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)Igf2干擾抑制了AKT和mTOR的磷酸化而Igf2過表達(dá)則促進(jìn)其磷酸化（圖4J-K）。作為PI3K-AKT-mTOR下游的LPIN1基因，Igf2干擾則促進(jìn)了其核內(nèi)表達(dá)，而Igf2過表達(dá)則抑制核內(nèi)LPIN1表達(dá)（圖4O-P）。

結(jié)果5?mmu_circ_0001874是miR-24-3p的分子海綿

鑒于miR-24-3p在肥胖動(dòng)物脂肪和肝臟中保持著較低的豐度，作者試著尋找一個(gè)上游circRNA，其可以作為miR-24-3p的分子海綿并參與脂質(zhì)代謝。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，174個(gè)差異circRNA被鑒定。在上調(diào)的circRNA中，有22個(gè)circRNA與miR-24-3p具有結(jié)合位點(diǎn)，其中，mmu_circ_0001874含有5個(gè)位點(diǎn)（圖5A）。通過收斂引物和發(fā)散引物擴(kuò)增，作者發(fā)現(xiàn)mmu_circ_0001874是一個(gè)具有“首尾結(jié)合”序列的circRNA（圖5B-C）。并且，在細(xì)胞和動(dòng)物中，mmu_circ_0001874表達(dá)在脂質(zhì)沉積后增強(qiáng)（圖5D）。雙熒光素酶報(bào)告分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了結(jié)合位點(diǎn)（圖5E-F）。同時(shí)，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)證明兩者具有一致的細(xì)胞定位（圖5G）。

結(jié)果6?mmu_circ_0001874的缺失抑制脂質(zhì)沉積

接下來，作者篩選出干擾效率較高的siRNA并進(jìn)行腺病毒載體構(gòu)建（圖6A-B）。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明mmu_circ_0001874的缺失抑制了動(dòng)物的體重增長(zhǎng)（圖6C），脂肪和肝臟重量（圖6D），血脂（圖6E），脂肪細(xì)胞橫切面積（圖6F），肝臟甘油三酯含量（圖6G）,脂肪和肝臟組織脂質(zhì)含量（圖6J），并改善GTT（圖6H）和ITT（圖6I）。此外，在脂肪和肝臟中，mmu_circ_0001874的缺失阻礙了高脂飲食介導(dǎo)的脂代謝相關(guān)因子和炎癥相關(guān)因子的表達(dá)增加（圖6K-N）。

結(jié)果7?mmu_circ_0001874調(diào)控高脂飲食介導(dǎo)的炎癥

在動(dòng)物血清中，作者發(fā)現(xiàn)mmu_circ_0001874缺失降低了循環(huán)瘦素水平但是增加了脂聯(lián)素的含量（圖7A）。在肥胖動(dòng)物脂肪、肝臟和血清中，mmu_circ_0001874的缺失降低了促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6（圖7B）。針對(duì)脂肪組織的熒光定量分析也表明促炎基因在mmu_circ_0001874缺失后表達(dá)下調(diào)（圖7C）。此外，免疫熒光驗(yàn)證了之前的結(jié)果（圖7D）。

結(jié)果8?mmu_circ_0001874結(jié)合Igf2bp2促進(jìn)Ucp1翻譯

這里，作者利用RBPsuite和catRAPID數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)Igf2bp2可能在多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合mmu_circ_0001874(圖8A-B)。當(dāng)mmu_circ_0001874缺失時(shí)，Igf2bp2的表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)(圖8C-E)。mmu_circ_0001874和Igf2bp2之間存在較好的共定位(圖8F)。RIP實(shí)驗(yàn)顯示Igf2bp2可以富集mmu_circ_0001874（圖8G）。接下來，作者發(fā)現(xiàn)mmu_circ_0001874缺失增加了線粒體基因(圖8H)。Igf2bp2干擾后細(xì)胞脂質(zhì)積累較少(圖8I)。此外，mmu_circ_0001874的缺乏導(dǎo)致Igf2bp2表達(dá)下降，但I(xiàn)gf2bp2基因沉默不影響mmu_circ_0001874的表達(dá)，這表明Igf2bp2不調(diào)節(jié)mmu_circ_0001874的穩(wěn)定性，但可能與mmu_circ_0001874相互作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝(圖8J)。PAR-CLIP測(cè)序分析顯示存在多個(gè)Igf2bp2靶mRNA。其中，產(chǎn)熱基因Ucp1也是Igf2bp2的靶mRNA。證據(jù)表明，Igf2bp2結(jié)合Ucp1 mRNA并抑制其翻譯。通過共轉(zhuǎn)染，mmu_circ_0001874缺失顯著提高了Igf2bp2基因沉默誘導(dǎo)的Ucp1表達(dá)(圖8K-L)。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1007/s00018-023-04899-1