生物分子類實驗室常用32個實驗技術(shù)原理匯總
生物分子類實驗室常用實驗技術(shù)原理匯總。
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一、GST pull-down實驗
基本原理:將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。注：GST即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)
二、足印法（Footprinting）
足印法（Footprinting）是一種用來測定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測目的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合。其原理為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase（脫氧核糖核酸酶）分解，在對目的DNA序列進行檢測時便出現(xiàn)了一段無DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸數(shù)目及其核苷酸序列。
三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)
（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達(dá)的關(guān)系。
染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別 反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。
四、基因芯片
（又稱 DNA 芯片、生物芯片）
技術(shù)基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術(shù) ，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作 。
基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。
五、高效液相色譜（HPLC）
高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。
高壓泵將貯液罐的流動相經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時整個系統(tǒng)就被流動相充滿。當(dāng)欲分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。?
六、酵母雙雜交（Y2H）
七、噬菌體展示技術(shù)
噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。
噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。
八、RNA提?。═rizol法）
Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。
九、RT-PCR
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。
實驗步驟：
1、RNA的提?。?/p>
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；
3、PCR擴增；
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。
十、實時熒光定量PCR
（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR?
利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。
閾值：是循環(huán)開始3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴增曲線指數(shù)增長期。
C(t)值：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。
十一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度
十二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α）制備
1、前夜接種受體菌（DH5?或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；
2、取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100ml LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；
3、將0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；
4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；
5、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；
7 、4℃下3000 g冷凍離心5分鐘；
8 、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；
9 、細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。
十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選
（1）總過程：
分---PCR分離目的基因
切---限制性內(nèi)切酶切割
接---目的基因與載體相連
轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞
篩---篩選陽性重組體
（2）分---PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選
（3）切---限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端
（4）接---目的基因與載體相連
原 理：利用DNA聚合酶反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個或者幾個A堿基的特性和利用T載體3’末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補配對,經(jīng)連接酶作用,完成與載體的連接。
（5）轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞
感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過電擊、 CaCl2、 RuCl等化學(xué)試劑處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細(xì)胞的狀態(tài)。
（6）篩---篩選陽性重組體
十五、RNA干擾（RNAi）
一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。
十六、cDNA 末端快速擴增技術(shù)
?(rapid amplification of cDNA ends,RACE)
cDNA 末端快速擴增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)是一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點,擴增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長cDNA5’和cDNA3’末端，進而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點,可同時獲得多個轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術(shù),成為克隆全長cDNA序列的常用手段。
十七、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建
基因文庫和cDNA文庫是生物學(xué)研究中常用的兩種文庫構(gòu)建方法，它們的構(gòu)建步驟略有不同。
1. 基因文庫的構(gòu)建步驟：
（1）DNA片段：首先從某個生物體中提取出總DNA，并使用特定的限制酶將其切成一定長度的DNA片段。?
（2）連接酶：接下來在DNA片段的兩端冷凍啞鈴形（blunt-ended）區(qū)域連接經(jīng)過處理的外源性連接酶或T4 DNA ligase。
（3）載體DNA：然后，選擇合適的載體DNA作為DNA片段的合成載體，將外源DNA片段無需配對直接固定到載體上。
（4）轉(zhuǎn)化操作：使用細(xì)胞質(zhì)植入技術(shù)將噬菌體介導(dǎo)的DNA插入到宿主細(xì)胞內(nèi)，使其進行自我復(fù)制和表達(dá)，完成了基因文庫的構(gòu)建。
2. cDNA文庫的構(gòu)建步驟：
（1）RNA提?。哼\用選擇性RNA裂解方法提取總RNA，通過級聯(lián)磷酸酸化聚乙二醇（PEG）/離子交換-氯仿萃取技術(shù)分離mRNA。
（2）反轉(zhuǎn)錄與合成：利用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成一鏈cDNA，然后加入RNase H和DNA聚合酶I合成相對應(yīng)的另一條鏈。
（3）連接操作：在cDNA的3'末端加上適當(dāng)?shù)倪B接物質(zhì)的同時還可以在cDNA 5’端中添加其他特定的引物，輕松地為其配對，并使用特定的連接酶連接cDNA與載體DNA。
（4）轉(zhuǎn)化操作：將其植入細(xì)胞內(nèi)并利用藍(lán)-白色選擇作用篩選正常重組克隆細(xì)胞完成構(gòu)建。
總而言之，基因文庫和cDNA文庫都是從生物樣本中分離、純化和增殖目標(biāo)DNA構(gòu)建一個大的、可操作的庫。其主要區(qū)別在于起始材料的來源和構(gòu)建方法。
十八、mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR）
mRNA差異顯示技術(shù)是將mRN A逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。每一種細(xì)胞（包括同一組織細(xì)胞經(jīng)過不同的處理）都有其特異表達(dá)的不同于其他組織細(xì)胞的基因譜（有差異基因表達(dá)），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達(dá)是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，正是這些基因在細(xì)胞中的特異表達(dá)與否，決定了生命歷程中細(xì)胞的發(fā)育和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T－PCR 技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。其基本原理是從基因背景相同的2個或幾個被比較的細(xì)胞系或組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，用不同引物對，進行PCR 擴增，擴增時加入同位素標(biāo)記的核苷酸。利用測序膠電泳技術(shù)分離PCR 產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達(dá)的基因。
十九、抑制差減雜交
抑制差減雜交技術(shù)原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)的主要技術(shù)有兩點:(1)消減雜交;(2)抑制PCR。經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達(dá)基因(目的基因),而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除,使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。
抽提兩種不同來源組織的mRNA(tester和driver),反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用4堿基識別酶(RsaI)或HaeIII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testerc DNA分成均等的兩份,分別接上dapter1和adapter2兩種接頭,并與過量的經(jīng)RsaI消化的driver樣本變性后退火雜交。第一次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester和driver的異源雙鏈;d是drivercDNA。
根據(jù)復(fù)性動力學(xué)原理,豐度高的單鏈cDNA退火時產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈cDNA,因此第一次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致。混合兩份雜交樣品,同時加入新的變性driver cDNA 進行第二次消減雜交。雜交完全后補平末端,加入合適引物(即adapter1和adapter2的部分特異序列)進行PCR擴增,只有含不同接頭的雙鏈DNA分子(e)才可進行指數(shù)擴增,擴增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點可進行克隆、測序等。
二十、蛋白質(zhì)芯片
蛋白質(zhì)芯片是一種高通量技術(shù)，可實現(xiàn)對蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析和檢測。其構(gòu)建和使用的基本步驟如下：
芯片設(shè)計：蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵在于探針的設(shè)計，包括選擇一系列用于特定的實驗?zāi)康牡牡鞍踪|(zhì)、制備純化這些蛋白質(zhì)，并將它們吸附到載玻片上。這個過程可以使用多種不同的抗體、親和和結(jié)合實驗來實現(xiàn)。
樣本處理：待測樣品中的復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物需要進行前處理，包括清除雜質(zhì)并使所有蛋白質(zhì)具有相同的加載條件。
芯片加標(biāo)：將前處理的樣品加入含有已經(jīng)固定的蛋白質(zhì)探針的芯片中，然后讓樣品中的蛋白質(zhì)與芯片表面的固定蛋白質(zhì)相結(jié)合。
信號檢測：通過熒光或化學(xué)染色等方法檢測已經(jīng)結(jié)合在芯片上的蛋白質(zhì)，并使用微電子學(xué)讀取儀器記錄下其強度和位置。芯片上的反應(yīng)會形成“斑點”，每個斑點代表一種特定的蛋白質(zhì)分子。
數(shù)據(jù)分析：最后，使用生物信息學(xué)方法將芯片產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行處理和歸納。通過與已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較，可以標(biāo)識從待測樣品中檢測到的蛋白質(zhì)，并確定它們在樣品中的相對數(shù)量、位置和功能等信息。
通過這些步驟，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)能夠有效地檢測復(fù)雜樣品中的數(shù)千種甚至百萬級
二十一、Northern blot
Northern blot是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測特定基因在細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)錄水平。Northern blot的步驟如下：
1. RNA提?。簭募?xì)胞或組織中提取總RNA并凈化。
2. 電泳：將RNA樣本按大小通過瓊脂糖凝膠電泳分離出來，并將RNA遷移到帶電性強、毛細(xì)孔結(jié)構(gòu)的膜上。
3. 固定RNA：使用紫外線或熱交聯(lián)使RNA固定在膜上。
4. 雜交：應(yīng)用已經(jīng)標(biāo)記的探針與膜表面的RNA雜交，讓探針與膜表面RNA序列互補配對。
5. 洗脫：用嚴(yán)格的條件與不希望被檢測到的非特異性雜交解離，同時徹底洗滌膜，以去除干擾信號。
6. 探針檢測：暴露探針標(biāo)記所使用放射性或熒光物質(zhì)并進行可視化。
通過這些步驟，可以單獨檢測到一個或多個目標(biāo)mRNA或奇異RNA（siRNA）的表達(dá)量，進而識別目標(biāo)基因的表達(dá)情況及其優(yōu)先表達(dá)組織或細(xì)胞。
二十二、Southern blot
Southern blot是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測DNA中特定序列的存在和數(shù)量。Southern blot的步驟如下：
1. DNA提?。簭募?xì)胞或組織中提取總DNA并進行純化。
2. 電泳：將DNA樣本按大小通過瓊脂糖凝膠電泳分離出來，并將DNA遷移到帶電性強、毛細(xì)孔結(jié)構(gòu)的膜上。
3. 固定DNA：使用紫外線或熱交聯(lián)使DNA固定在膜上。
4. 雜交：應(yīng)用已經(jīng)標(biāo)記的探針與膜表面的DNA雜交，讓探針與膜表面DNA序列互補配對。
5. 洗脫：用嚴(yán)格的條件與不希望被檢測到的非特異性雜交解離，同時徹底洗滌膜，以去除干擾信號。
6. 探針檢測：暴露探針標(biāo)記所使用放射性或熒光物質(zhì)并進行可視化。
通過這些步驟，可以單獨檢測到一個或多個目標(biāo)DNA序列的存在和數(shù)量，并進一步確定目標(biāo)基因的基因型和篩查突變狀態(tài)。
二十三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移?
二十四、雙分子熒光技術(shù)
二十五、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）
ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA） ?；A(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。
二十六、雙向凝膠電泳（2-DE）
?雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。
二十七、mRNA的分離與純化
（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）
真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。
二十八、His-tag純化蛋白
His?Tag序列（6、8或10個連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在基于NTA(氮川三乙酸鎳) -和IDA- 的His?Bind樹脂上的二價陽離子Ni2+結(jié)合。洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脫并回收目標(biāo)蛋白。該通用系統(tǒng)使得可在溫和、非變性條件，或存在6M胍或尿素條件下純化蛋白。
二十九、RNA酶保護試驗方法
(RNase Protection Assay，RPA)
(RNase Protection Assay，RPA)RNA酶保護法是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2. 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4.步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。6. 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7. 檢測分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標(biāo)記探針。
三十、免疫組化
通過將次級抗體與標(biāo)記物結(jié)合，利用特異性抗體在細(xì)胞或組織切片上檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在和分布。常見的免疫組化步驟如下：
1. 取得樣本：獲取待檢測的細(xì)胞或組織切片。
2. 抗原修復(fù)：利用高壓力、高溫或酶解等方法，使樣本中的蛋白質(zhì)達(dá)到可被抗體識別的狀態(tài)。
3. 封閉非特異性結(jié)合位點：采用BSA等通用蛋白或牛血清白蛋白（BSA）等蛋白質(zhì)進行預(yù)處理以堵塞非特異性結(jié)合位點，減少假陽性。
4. 一級抗體孵育：將與目標(biāo)蛋白特異抗體相對應(yīng)的一級抗體加入到樣品中，使其與目標(biāo)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
5. 洗滌：去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。
6. 二級抗體孵育：加入帶有熒光素或辣根過氧化酶等標(biāo)記物的結(jié)合了一級抗體的二級抗體，使其與一級抗體結(jié)合。
7. 洗滌：去除未結(jié)合的二級抗體和雜質(zhì)。
8. 可視化：通過激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，對在細(xì)胞或組織切片上的目標(biāo)蛋白質(zhì)進行成像。
通過這些步驟，可以檢測到待測樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)分布情況，進而對相關(guān)疾病的診斷和治療提供幫助。
三十一、各種分子標(biāo)記技術(shù)的比較
限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標(biāo)記,開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA 多態(tài)性的新階段,是最早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù) 。RFLP 是檢測DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA 序列上的微小變化,甚至1 個核苷酸的變化,也能引起限制性內(nèi)切酶切點的丟失或產(chǎn)生, 導(dǎo)致酶切片段長度的變化。
隨機擴增多態(tài)DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術(shù),由于其獨特的檢測DNA 多態(tài)性的方式使得RAPD 技術(shù)很快滲透于基因研究的各個領(lǐng)域。RAPD 是建立于PCR 基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù),基本原理是利用一個隨機引物(8～10 個堿基) 通過PCR 反應(yīng)非定點地擴增DNA 片段,然后用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA 多態(tài)性研究。對任一特定引物而言,它在基因組DNA 序列上有其特定的結(jié)合位點,一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA 片段插入、缺失或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化,從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變,表現(xiàn)出多態(tài)性。
擴增片段長度多態(tài)技術(shù)(AFLP) ,又名限制片段選擇擴增技術(shù)(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發(fā)明。AFLP 是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù),它將基因組DNA 用成對的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與酶切位點互補) 連接起來,并通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA 片段,從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP 指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。
SSR 也稱微衛(wèi)星DNA ,是一類由幾個(多為2～6個) 堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列,其中最常見的是雙核苷酸重復(fù),即(CA) n和(TG) n ,每個微衛(wèi)星DNA 的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復(fù)單位數(shù)目10～60 個,其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同,導(dǎo)致了SSR 長度的高度變異性,這一變異性正是SSR 標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。
單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA 分子標(biāo)記,是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異,這種差異包括單個堿基的缺失或插入 ,更常見的是單個核苷酸的替換,且常發(fā)生在嘌呤堿基(A 與G) 和嘧啶堿基(C 與T) 之間。SNP 標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異,被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記。
三十二：核糖體譜技術(shù)
隨著二代測序技術(shù)的深入發(fā)展，基于核糖體保護的 mRNA 不被核糖核酸酶所降解而保留下來，而裸露的 mRNA 被消化的原理，獲得基因組范圍內(nèi)核糖體覆蓋的 mRNA 片段，并對這些片段進行深度測序，從而提出了全基因組范圍內(nèi)分析核糖體的分布情況，同時可以進一步在單核苷酸水平上分析蛋白質(zhì)翻譯事件的技術(shù)。
構(gòu)建核糖體譜的一般實驗法和數(shù)據(jù)處理流程如下：
a.對培養(yǎng)的細(xì)胞用翻譯延伸抑制劑真核生物一般使用放線菌酮(cycloheximide)，細(xì)菌一般使用氯霉素(chloramphenicol)處理，可以使正在翻譯的核糖體停滯在 mRNA 上，然后獲得核糖體滯留在正在翻譯中的 mRNA 的細(xì)胞提取物；
b.用核糖核酸酶處理細(xì)胞提取物可以酶解未被核糖體保護的 mRNA 片段，然后回收被核糖體保護的 mRNA 片段，蔗糖密度梯度離心法分離核糖體和mRNA 片段． 將核糖體保護的片段定量地轉(zhuǎn)化為可被深度測序的 cDNA 文庫.測序法與轉(zhuǎn)錄本測序類似；
c ． 測序讀段的定位．參考序列一般來自于UCSC Known Genes database 或 利用 UCSC Table Browser 生成相應(yīng)的參考序列． 其他來源的基因組注釋 文 件 也 是可以 接受的 ． 讀 段 定 位 可 使 用bowtie2或者 TopHat等軟件完成；
d．計算平均讀段密度和分析翻譯效率、翻譯差異． 一般排除讀段數(shù)極少的轉(zhuǎn)錄本． 讀段密度單位 一 般；
為 RPKM (reads per kilobase per millionmapped reads)． 翻譯效率定義為核糖體足跡密度與mRNA讀段密度的比率．標(biāo)準(zhǔn)化法是將所有基因的翻譯效率均除以所有基因的翻譯效率的中位數(shù). 翻譯差異的計算，為對應(yīng)的樣本組之間的比值．標(biāo)準(zhǔn)化法同上，這樣可以排除樣本間總讀段數(shù)差異的干擾。
