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納米粒子介導(dǎo)的TRPV1通道阻斷通過

熱休克因子1調(diào)制放大癌癥熱免疫療法

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子:（2021IF：17.6939，JCRQ1）

發(fā)表時(shí)間：2023年4月23日

作者：Huabing Chen教授

4T1、HCT116、HEK293T-EGFP、PANC02細(xì)胞購自逸漠生物(IMMOCELL)

研究背景

惡性腫瘤的存活高度依賴于其內(nèi)在的自我防御途徑，例如癌癥治療期間的熱休克蛋白(HSP)。然而，精確拆除自我防御以增強(qiáng)抗腫瘤效力仍未得到探索。

摘要部分

在此，研究人員證明納米顆粒介導(dǎo)的瞬時(shí)受體電位香草素成員1(TRPV1)通道阻斷通過抑制熱休克因子1(HSF1)介導(dǎo)的雙重自衛(wèi)途徑來增強(qiáng)熱免疫療法。TRPV1阻斷抑制熱療誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流和隨后的HSF1核轉(zhuǎn)位，從而選擇性地抑制應(yīng)激性過度表達(dá)的HSP70，以增強(qiáng)對(duì)各種原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤模型的熱療效果。特別是，抑制HSF1易位進(jìn)一步抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)途徑降解腫瘤基質(zhì)，從而促進(jìn)抗腫瘤治療藥物（例如抗PD-L1抗體）和免疫細(xì)胞向高度纖維化和免疫抑制的胰腺癌的浸潤。結(jié)果，TRPV1阻斷恢復(fù)了具有可根除腫瘤和免疫記憶效應(yīng)的熱免疫療法。納米粒子介導(dǎo)的TRPV1阻斷代表了一種有效的方法來消除有效癌癥治療的自我防御。

研究內(nèi)容

1.?TRPV1阻斷或敲低增強(qiáng)熱細(xì)胞毒性

為了產(chǎn)生有效的熱療以產(chǎn)生癌癥熱療，白蛋白納米顆?；\罩硫化銅納米晶體（CuSNCs）被構(gòu)建為如前所述的光熱源，其具有7.8nm的核心尺寸和25.4nm的流體動(dòng)力學(xué)直徑。在近紅外光照射下，這些CuS-NCs在濃度為1.0mMCu的情況下，在300s內(nèi)表現(xiàn)出濃度依賴性溫度升高約30°C，顯示出明顯的光熱轉(zhuǎn)換能力，由于顯著的近-紅外吸收。為了評(píng)估TRPV1阻斷對(duì)熱療介導(dǎo)的CuS-NC細(xì)胞毒性的影響，將特異性TRPV1拮抗劑SB705498應(yīng)用于同時(shí)用CuS-NC處理的野生型A549(A549-WT)細(xì)胞，然后5分鐘1.5Wcm.2的光暴露和隨后使用MTT測定法評(píng)估對(duì)A549-WT細(xì)胞的光細(xì)胞毒性。在沒有光照的情況下與SB705498或CuS-NC孵育后，A549-WT細(xì)胞的活力保持相對(duì)不變。

然而，在來自CuS-NCs(0.2mM)的熱療后，SB705498(0-20nM)顯示出細(xì)胞毒性的濃度依賴性改善，與20nMSB705498相比，40nMSB705498沒有引起細(xì)胞毒性的明顯增加。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用20nMSB705498阻斷TRPV1離子通道以增強(qiáng)熱細(xì)胞毒性。在存在SB705498的情況下，來自CuS-NC的熱療在光照下的IC50為0.25mM，而在沒有SB705498的情況下在光照下觀察到IC50明顯增加（0.39mM）（圖1a）。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)SB705498通過增加細(xì)胞培養(yǎng)溫度來放大熱療介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。這些結(jié)果表明，SB705498介導(dǎo)的TRPV1阻斷是熱細(xì)胞毒性明顯改善的原因。此外，5-乙炔基-20-脫氧尿苷(EdU)染色經(jīng)常用于通過監(jiān)測綠色熒光檢測S期增殖細(xì)胞，以驗(yàn)證SB705498介導(dǎo)的TRPV1阻斷改善CuSNC熱細(xì)胞毒性的能力.在沒有光照的情況下，無論是否結(jié)合SB705498，CuS-NC都不會(huì)對(duì)A549-WT細(xì)胞增殖造成損害。相反，在光照下，SB705498明顯促進(jìn)了基于熱療的細(xì)胞毒性，綠色熒光強(qiáng)度最低，表明S期增殖細(xì)胞較少。因此，SB705498介導(dǎo)的TRPV1阻斷顯著改善了熱療時(shí)的熱細(xì)胞毒性。

為了驗(yàn)證TRPV1阻斷與熱療的協(xié)同作用，研究人員使用帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽的TRPV1shRNA建立了穩(wěn)定的A549-TRPV1敲低(A549-TRPV1KD)細(xì)胞。如圖1b，超過90%的細(xì)胞呈GFP陽性，A549-TRPV1KD細(xì)胞中的TRPV1表達(dá)水平明顯低于A549-WT細(xì)胞，證實(shí)了有效的敲低TRPV1。然后，MTT測定顯示來自CuS-NCs的熱療具有比A549-TRPV1KD細(xì)胞(0.20mM)高1.7倍的IC50值0.35mMinA549-WT細(xì)胞（圖1c）。然而，A549細(xì)胞中TRPV1離子通道的過表達(dá)大大降低了CuS-NC的熱細(xì)胞毒性，IC50值為0.45mM。這些結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中TRPV1的敲低明顯促進(jìn)了熱細(xì)胞毒性。由于A549-WT和A549-TRPV1KD細(xì)胞對(duì)CuS-NC的細(xì)胞攝取相似，因此腫瘤細(xì)胞中TRPV1通道的敲低合理地參與了熱療介導(dǎo)的熱細(xì)胞毒性的增強(qiáng)。

由于TRPV1阻斷有效地協(xié)同熱療效率，研究人員進(jìn)一步探索了SB705498作為TRPV1拮抗劑逃避熱阻的機(jī)制。TRPV1通道作為主導(dǎo)鈣內(nèi)流的溫度敏感鈣離子通道，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，研究人員假設(shè)Ca2+流入可能在熱療過程中發(fā)揮重要作用，這可能與HSF1核易位和隨后的應(yīng)激性HSP70上調(diào)有關(guān)（圖1d）。為了清楚地觀察各種處理后Ca2+的流入，使用了紅色熒光Ca2+結(jié)合染料(CalciFluorTM Rhod-4,AM)。CuS-NCs的熱療誘導(dǎo)A549-WT細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca2+的急劇增加，如紅色熒光強(qiáng)度顯著提高（比PBS組高7.9倍）所示，而SB705498或TRPV1敲低對(duì)TRPV1的阻斷明顯抑制這種細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加（圖1e）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ca2+流入是否依賴于細(xì)胞外Ca2+，研究人員利用細(xì)胞外Ca2+螯合劑乙二醇-雙（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)來清除細(xì)胞外Ca2+在介質(zhì)中。

顯然，清除細(xì)胞外Ca2+導(dǎo)致紅色熒光的增加可忽略不計(jì)，表明Ca2+流入對(duì)細(xì)胞外Ca2+的特定依賴性（圖1e）。此外，使用CalciFluorTMRhod-4，AM探針對(duì)來自細(xì)胞內(nèi)Ca2+的紅色熒光進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，進(jìn)一步證實(shí)了TRPV1阻斷或敲低抑制Ca2+流入的能力。因此，熱療敏感地激活TRPV1通道介導(dǎo)的Ca2+流入（圖1d），這明顯不利于熱細(xì)胞毒性，而這種Ca2+流入也能夠被TRPV1阻斷有效抑制。

研究人員使用MTT法進(jìn)一步證明了Ca2+流入對(duì)CuS-NCs的熱細(xì)胞毒性的影響，其中無毒的EGTA作為鈣清除劑在2.0mM的劑量下導(dǎo)致CuS-NCs在高溫下的IC50約為0.24mM,優(yōu)于單獨(dú)熱療的細(xì)胞毒性(~0.35mM)。因此，使用EGTA清除細(xì)胞外Ca2+表現(xiàn)出與無毒SB705498相似的行為，如圖1a所示。之后，EdU染色進(jìn)一步顯示，與光照下單獨(dú)的熱療相比，EGTA存在下的熱療對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生更好的抑制作用，證實(shí)通過TRPV1通道阻斷Ca2+流入能夠增強(qiáng)熱細(xì)胞毒性。

隨后，還利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估不同處理下A549-WT細(xì)胞的凋亡。單獨(dú)的CuS-NCs介導(dǎo)的熱療引起62.3%的細(xì)胞凋亡水平，而通過TRPV1拮抗劑SB705498或鈣螯合劑EGTA有效抑制Ca2+流入導(dǎo)致光照下CuS-NCs在熱療下細(xì)胞凋亡明顯增加(75.2%)，表明熱療激活的Ca2+內(nèi)流明顯損害熱療效率。此外，蛋白質(zhì)印跡也用于驗(yàn)證細(xì)胞凋亡行為，與SB705498、EGTA或TPRV1敲除相比較，在CuS-NCs介導(dǎo)的熱療下觀察到A549-WT細(xì)胞裂解的caspase-3表達(dá)增強(qiáng)僅在熱療下。值得注意的是，TRPV1阻斷協(xié)同熱細(xì)胞毒性并通過有效阻斷Ca2+流入促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

進(jìn)一步闡明抑制Ca2+流入熱療引起的協(xié)同機(jī)制，其中Ca2+可能與細(xì)胞熱休克反應(yīng)有關(guān)，包括熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)易位到細(xì)胞核，以及隨后的應(yīng)激HSP7029的轉(zhuǎn)錄和最終翻譯。因此，研究人員應(yīng)用免疫熒光染色來評(píng)估TRPV1阻斷在干擾CuS-NC引起的高溫下腫瘤細(xì)胞的核內(nèi)HSF1易位和細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)中的作用。單獨(dú)的熱療導(dǎo)致HSF1明顯的核轉(zhuǎn)位，HSF1和細(xì)胞核的共定位率為84.6%（圖1f），隨后HSP70在A549-WT細(xì)胞中過表達(dá)（圖1g）,表明熱療特別激活應(yīng)激性HSP70表達(dá)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)SB705498共孵育或TRPV1敲低明顯阻斷HSF1核轉(zhuǎn)位，共定位率分別為24.4%和35.6%（圖1f），并抑制熱療下應(yīng)激性HSP70上調(diào)，分別與核內(nèi)HSF1和細(xì)胞內(nèi)HSP70水平相關(guān)的幾乎不變的熒光信號(hào)證明了這一點(diǎn)（圖1g）。特別是，為了驗(yàn)證Ca2+流入的阻斷是否解釋了HSF1易位和應(yīng)激性HSP70上調(diào)的抑制，EGTA(2.0mM)也用于清除培養(yǎng)基中的Ca2+。EGTA明顯抑制HSF1的核內(nèi)轉(zhuǎn)位和A549-WT細(xì)胞在光照射下來自CuS-NC的熱療下應(yīng)激性HSP70上調(diào)（圖1f、g），類似于SB705498的行為。此外，還使用蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證了TRPV1阻斷抑制HSF1核內(nèi)易位和隨后熱療后應(yīng)激性HSP70上調(diào)的能力。與僅從CuS-NCs接受熱療的A549-WT細(xì)胞相比，TRPV1阻斷和敲低均導(dǎo)致核內(nèi)HSF1表達(dá)的顯著降低，這解釋了應(yīng)激性HSP70的有效下調(diào).這些結(jié)果證明了TRPV1阻斷或敲低抑制HSF1核內(nèi)易位以下調(diào)應(yīng)激性HSP70，最終協(xié)同熱療的能力。

為了研究SB705498介導(dǎo)的TRPV1阻斷對(duì)體內(nèi)熱療效力的協(xié)同作用，將A549-WT細(xì)胞或A549-TRPV1KD細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，分別建立A549-WT腫瘤或A549-TRPV1KD腫瘤模型。值得注意的是，在注射A549-WT或A549-TRPV1KD腫瘤的小鼠中，在注射后24小時(shí)，腫瘤積聚相似，約為7.2%IDg.1，劑量為30.0μmolkg的CuS-NC.1Cu在注射后24小時(shí)光照下導(dǎo)致A549-WT和A549-TRPV1KD腫瘤在5分鐘內(nèi)溫度升高(ΔT)~12.8°C和~12.6°C（圖1h),分別表明CuS-NCs在兩種腫瘤模型中引起相似的熱療。為了觸發(fā)體內(nèi)熱療，將CuS-NCs以30.0μmolkg.1的劑量靜脈注射到攜帶皮下A549-WT和A549-TRPV1KD腫瘤的小鼠體內(nèi)，然后將小鼠暴露于785nm光照射（5分鐘，1.5Wcm.2)在注射后24小時(shí)。同時(shí)，SB705498（1.0mgkg.1）在照射前30分鐘進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射，以在A549-WT腫瘤模型中誘導(dǎo)TRPV1阻斷，然后在注射后30天內(nèi)監(jiān)測腫瘤體積。PBS組中攜帶A549-WT腫瘤和A549-TRPV1KD腫瘤的小鼠表現(xiàn)出相似的腫瘤生長曲線，在30天內(nèi)增加了約15.0倍（圖1i），表明TRPV1通道本身沒有影響在非高溫條件下對(duì)腫瘤生長的影響。TRPV1敲低對(duì)腫瘤生長的影響可以忽略不計(jì)，可能是由于相對(duì)較短的監(jiān)測期。有趣的是，在CuS-NCs熱療后，A549-WT腫瘤被迅速消融，但隨后在照射后14天出現(xiàn)明顯復(fù)發(fā)（圖1i），表明僅熱療難以根除腫瘤由于腫瘤細(xì)胞對(duì)熱療的抵抗力。重要的是，在TRPV1阻斷或敲低后，來自CuS-NC的熱療完全消除了腫瘤，沒有任何復(fù)發(fā)和可忽略不計(jì)的體重變化（圖1i），這進(jìn)一步通過對(duì)腫瘤的嚴(yán)重組織學(xué)損傷和通過蘇木精和伊紅(H&E)染色和Ki67染色有效抑制細(xì)胞增殖。特別是，TRPV1阻斷和敲低都產(chǎn)生了類似的協(xié)同能力，證實(shí)TRPV1阻斷在對(duì)抗癌癥熱療中的熱阻方面起著至關(guān)重要的作用。此外，在沒有光照射的情況下，CuS-NCs對(duì)兩種腫瘤模型的腫瘤生長也沒有影響（圖1i），表明來自光可激活的CuS-NCs的熱療確保了針對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性熱療。

研究人員接下來使用免疫熒光染色研究了高溫下A549-WT和A549-TRPV1KD腫瘤模型中應(yīng)激性HSP70的體內(nèi)表達(dá)。對(duì)于單獨(dú)的CuS-NCs介導(dǎo)的熱療，觀察到來自腫瘤切片HSP70表達(dá)的明顯紅色熒光，這明顯高于沒有熱療的情況，表明熱療后腫瘤在體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激性HSP70（圖1j）。重要的是，使用SB705498或TRPV1敲低的TRPV1阻斷有效地抑制了腫瘤切片的體內(nèi)應(yīng)激HSP70表達(dá)，同時(shí)對(duì)正常表達(dá)的HSP70沒有明顯影響（圖1j）。這表明TRPV1阻斷特異性地抑制了應(yīng)激性HSP70在腫瘤部位的體內(nèi)表達(dá)。TUNEL染色還用于評(píng)估TRPV1阻斷對(duì)熱療后A549-WT和A549-TRPV1KD腫瘤模型的腫瘤體內(nèi)損傷的影響。在沒有熱療的情況下，對(duì)于TRPV1敲低觀察到可忽略的紅色熒光，表明TRPV1通道本身對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的無毒特性（圖1j）。單獨(dú)的熱療在腫瘤切片中引起明顯的細(xì)胞凋亡行為，增強(qiáng)的紅色熒光證實(shí)了這一點(diǎn)，而SB705498或TRPV1敲低進(jìn)一步放大了熱療引起的腫瘤切片的細(xì)胞凋亡水平（圖1j）。SB705498介導(dǎo)的TRPV1阻斷通過阻斷Ca2+流入以限制HSF1的核轉(zhuǎn)位和應(yīng)激性HSP70過表達(dá)來增強(qiáng)熱療損傷（圖1d）。

圖1.TRPV1阻斷或敲低通過阻斷Ca2+流入和抑制HSF1核轉(zhuǎn)位以抑制應(yīng)激性HSP70上調(diào)來增強(qiáng)熱療效果

研究結(jié)論：TRPV1阻斷或敲低通過阻斷Ca2+流入和抑制HSF1核轉(zhuǎn)位以抑制應(yīng)激性HSP70上調(diào)來增強(qiáng)熱療效果。TRPV1阻斷通過阻斷Ca2+流入和抑制隨后的HSF1核易位介導(dǎo)的應(yīng)激性HSP70上調(diào)來放大熱細(xì)胞毒性。TRPV1阻斷或敲低可有效增強(qiáng)體內(nèi)熱療功效。

2.?轉(zhuǎn)錄組分析揭示了TRPV1阻斷和熱療之間的潛在協(xié)同作用

為了徹底研究TRPV1阻斷對(duì)熱療的影響，在用CuS-NCs介導(dǎo)的熱療和SB705498處理后對(duì)A549-WT細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。明顯地，發(fā)現(xiàn)了熱療組合的23個(gè)上調(diào)基因和30個(gè)下調(diào)基因根據(jù)主成分分析和聚類分析，TRPV1阻斷與PBS相比（圖2a，P<0.05且倍數(shù)變化≥2）。如圖2b所示，與PBS相比，對(duì)于TRPV1與熱療的協(xié)同作用，觀察到負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的4932個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的明顯差異。此外，基因本體論(GO)分析顯示，這53個(gè)明顯可變的基因與生物過程、分子功能和細(xì)胞成分密切相關(guān)（圖2c）。其中，那些與結(jié)合相關(guān)的基因可能與癌細(xì)胞凋亡和遷移有關(guān)，揭示了TRPV1阻斷協(xié)同熱療的強(qiáng)大能力。在圖2d中，使用Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes/Proteins(STRING)網(wǎng)絡(luò)分析來確定不同的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，發(fā)現(xiàn)六種功能蛋白主要參與細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞熱反應(yīng)、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)代謝過程和細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控。此外，京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析表明，這些可變基因與幾種特定的細(xì)胞內(nèi)通路特別相關(guān)，包括Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，與外部熱療刺激、p53信號(hào)傳導(dǎo)、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的調(diào)節(jié)有關(guān)途徑和抑制與腫瘤遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶，表明TRPV1阻斷有效調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡并可能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移（圖2e）。

圖2.TRPV1阻斷與熱療協(xié)同作用的轉(zhuǎn)錄組分析

研究結(jié)論：因此，轉(zhuǎn)錄組分析表明，TRPV1阻斷和溫?zé)岑煼ㄖg的協(xié)同作用與細(xì)胞凋亡、遷移和轉(zhuǎn)移高度相關(guān)。

3.?納米顆粒介導(dǎo)的TRPV1拮抗劑靶向遞送用于選擇性TRPV1阻斷協(xié)同熱細(xì)胞毒性

TRPV1阻斷被鑒定為通過腫瘤內(nèi)TRPV1拮抗劑(SB705498)與CuS-NCs觸發(fā)的熱療的組合誘導(dǎo)增強(qiáng)的癌癥熱療，如上所示。為了實(shí)現(xiàn)TRPV1拮抗劑與熱療的合理協(xié)同作用，研究人員使用聚（乙二醇）114-bpoly構(gòu)建了載有ICG/SB705498的聚合物膠束（IS-Micelles，載藥效率分別為7.5%ICG和5.0%SB705498）（己內(nèi)酯）60(PEG114-PCL60)作為載體，它們有望通過靜脈注射將TRPV1拮抗劑和光熱ICG同步共同遞送到腫瘤中（圖3a）。ISM膠束的透射電子顯微鏡(TEM)直徑分別為~42.8nm和流體動(dòng)力學(xué)直徑~75.6nm（圖3b）。載有ICG的聚合物膠束（在TEM中直徑為43.2nm的I-膠束）被制造為僅具有熱療功能的對(duì)照。為了確認(rèn)IS-膠束產(chǎn)生熱療的能力，在光照（785nm，1.5Wcm.2）下5分鐘內(nèi)監(jiān)測溫度升高。這些膠束表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性溫度升高（圖3c），這合理地歸因于它們22.7%的高光熱轉(zhuǎn)換效率。此外，IS-膠束在pH7.4時(shí)表現(xiàn)出相對(duì)較低的SB705498釋放，而在pH6.5和5.5時(shí)觀察到SB705498從IS-膠束釋放增加，這是由于SB705498在酸性pH下的溶解度增加（圖3d），從而有助于腫瘤微環(huán)境可激活釋放以有效阻斷TRPV1。

然后研究人員評(píng)估了4T1-Luc三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞對(duì)IS-膠束的細(xì)胞攝取，這些細(xì)胞具有與A549-WT細(xì)胞相似的TRPV1通道表達(dá)水平。IS-膠束通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑表現(xiàn)出ICG的時(shí)間依賴性攝取，氯丙嗪處理后ICG的細(xì)胞攝取減少證明了這一點(diǎn)。特別是，研究人員使用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)進(jìn)一步評(píng)估了IS-膠束的細(xì)胞內(nèi)分布。觀察到IS-膠束與溶酶體的共定位率為94.8%，但由于溶酶體膜破裂和隨后的細(xì)胞質(zhì)易位，在光照下降低至18.9%。合理地，來自ISM膠束的活性氧物質(zhì)(ROS)的有效產(chǎn)生解釋了溶酶體膜的破壞，正如在光照下孵化IS-膠束后它們的二氫乙錠(DHE)染色具有明顯的紅色熒光所證實(shí)的。此外，使用吖啶橙(AO)染色進(jìn)一步驗(yàn)證了IS-膠束破壞溶酶體膜的能力，光照射后溶酶體中的紅色熒光完全消失。為了驗(yàn)證IS-Micelles阻斷TRPV1的能力，研究人員首先使用Fluo-8使用CLSM監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)Ca2+積累。顯然，由于通過TRPV1阻斷抑制Ca2+流入，IS-膠束在光照射下顯示出比I-膠束低得多的綠色熒光信號(hào)。因此，有效的細(xì)胞攝取、細(xì)胞質(zhì)易位和pH響應(yīng)釋放可能會(huì)促進(jìn)SB705498從IS-膠束到TRPV1通道的可及性，以實(shí)現(xiàn)有效的TRPV1阻斷。

為了證實(shí)IS-膠束阻斷TRPV1協(xié)同熱療的能力，通過MTT測定評(píng)估熱細(xì)胞毒性，IS-膠束和I-膠束的IC50分別為～6.8μgmL.1和～8.4μgmL.1（圖3e)。EdU染色進(jìn)一步表明，與光照射下的I-膠束相比，IS-膠束對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果更好（圖3f，g）。此外，研究人員應(yīng)用HSF1和HSP表達(dá)的免疫熒光染色來驗(yàn)證靶向共遞送策略是否可以有效克服熱療期間的熱阻。顯然，在光照射下IS-膠束的熱療觀察到細(xì)胞核中HSF1的紅色熒光可忽略不計(jì)，而作為對(duì)照的I-膠束顯示由于缺乏TRPV1阻斷而導(dǎo)致HSF1明顯的細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核中（圖3h)。從而導(dǎo)致應(yīng)激性HSP70明顯上調(diào)（圖3i，j）。相比之下，通過TRPV1拮抗劑的有效共遞送，IS-膠束組中的腫瘤細(xì)胞與照射后的PBS相比沒有顯示明顯的HSP70表達(dá)變化（圖3i，j），表明ISMicelles是能夠通過有效的TRPV1阻斷來阻止應(yīng)激性HSP70過表達(dá)以克服耐熱性。此外，流式細(xì)胞術(shù)用于通過AnnexinV-FITC/PI染色評(píng)估細(xì)胞凋亡行為。IS-膠束導(dǎo)致約71.7%的細(xì)胞凋亡，與單獨(dú)熱療的I-膠束(59.4%)相比，顯示出更好的熱細(xì)胞毒性（圖3k，l），這也通過HSP70表達(dá)降低得到證明并在蛋白質(zhì)印跡中明顯上調(diào)裂解的caspase-3。

圖3.使用聚合物膠束共同遞送TRPV1拮抗劑和光熱劑可實(shí)現(xiàn)TRPV1阻斷協(xié)同熱細(xì)胞毒性

研究結(jié)論：這些數(shù)據(jù)清楚地表明，IS-膠束的共遞送策略成功地促進(jìn)了TRPV1阻斷以克服熱阻，通過提高SB705498對(duì)TRPV1通道的可及性來增強(qiáng)它們的熱細(xì)胞毒性。

4.?TRPV1阻斷協(xié)同熱療通過靶向遞送IS-膠束在體內(nèi)抑制原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性TNBC腫瘤

為了證明IS-Micelles對(duì)TNBC的協(xié)同抗腫瘤功效，研究人員首先通過靜脈注射7.5mgkg.1ICG和5.0mgkg劑量的IS-Micelles評(píng)估了它們在攜帶原位4T1-Luc乳腺腫瘤的小鼠中的生物分布。1SB705498。注射后24小時(shí)后，IS-膠束和I-膠束在腫瘤部位均表現(xiàn)出約2.6%IDg.1的有效腫瘤生物分布（圖4a），這與光照射下約13.0°C的可比熱療有關(guān)（圖4b)。然后，研究人員使用初級(jí)抗N-鈣粘蛋白初級(jí)抗體和Alexa Fluor488偶聯(lián)二級(jí)抗體通過腫瘤細(xì)胞膜染色評(píng)估了IS-膠束的體內(nèi)腫瘤微分布。觀察到IS-膠束在腫瘤基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)空間的均勻分布，證實(shí)了TRPV1拮抗劑和光熱劑深入和均勻地滲透到腫瘤中。此外，研究人員通過免疫熒光染色研究了IS-膠束的滲透深度血小板和內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(PECAM-1)一抗和AlexaFluor488偶聯(lián)二抗。由于尺寸分布合適，IS-膠束在小4T1腫瘤（~75mm3）中表現(xiàn)出相當(dāng)大的外滲和約100μm的深穿透深度。由于高滲透性4T1腫瘤中的豐富血管，IS-膠束在大型4T1腫瘤（~250mm3）中仍然表現(xiàn)出均勻和深度的滲透，與小型4T1腫瘤中的ISM膠束相當(dāng)。

為了探索TRPV1阻斷與溫?zé)岑煼ǖ捏w內(nèi)協(xié)同作用，將IS-膠束以7.5mgkg.1ICG和5.0mgkg.1SB705498的單劑量給藥到原位4T1-Luc乳腺腫瘤荷瘤小鼠中，然后用光曝光(785nm,1.5Wcm.2)5分鐘，隨后在注射后21天內(nèi)測量腫瘤體積。無論光照如何，PBS觀察到腫瘤體積增加約47.5倍，ISMicelles和I-Micelles組中沒有照射的小鼠也顯示出與PBS相似的腫瘤生長，正如它們的生物發(fā)光圖像所驗(yàn)證的那樣（圖4c，d）。重要的是，IS-Micelles導(dǎo)致腫瘤完全根除，照射后沒有任何再生，而單獨(dú)熱療的I-Micelles由于注射后7天腫瘤快速復(fù)發(fā)，腫瘤體積增加了約14.9倍（圖4c，d）.此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠的腫瘤重量進(jìn)一步證實(shí)了與I-膠束相比，ISMicelles具有更好的抗腫瘤功效（圖4e）。值得注意的是，TRPV1阻斷策略在通過照射腫瘤上的IS-膠束來根除從過熱中幸存的腫瘤細(xì)胞方面顯示出明顯的優(yōu)勢。為了進(jìn)一步證實(shí)TRPV1阻斷與溫?zé)岑煼ǖ膮f(xié)同作用引起的腫瘤損傷，在照射后6小時(shí)收集遭受不同治療的4T1-Luc乳腺腫瘤用于隨后的組織學(xué)、Ki67和TUNEL染色。光照射后，與I-膠束相比，IS-膠束表現(xiàn)出更嚴(yán)重的組織學(xué)損傷、更少的細(xì)胞增殖和更好的細(xì)胞凋亡。

特別是，在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)同時(shí)觀察到肺部4T1-Luc轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的生物發(fā)光。由于有效根除原發(fā)性腫瘤，IS-膠束完全根除了肺部的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，而I-膠束在原位4T1-Luc腫瘤的肺部產(chǎn)生了顯著的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（圖4f，g）。此外，進(jìn)一步應(yīng)用H&E染色以驗(yàn)證它們通過IS-膠束處理對(duì)肺部轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的有效抑制，而I-膠束仍觀察到一些轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（圖4f，g）。顯然，TRPV1阻斷在有效抑制遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)方面起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗鼈儏⑴c了EMT通路的調(diào)節(jié)（圖2e），盡管IS-膠束僅在原發(fā)性腫瘤處發(fā)揮局部熱療作用。

受ISMicelles相當(dāng)大的熱療功效的啟發(fā)，研究人員進(jìn)一步評(píng)估了它們對(duì)術(shù)后失敗的原位TNBC的抗腫瘤功效。簡而言之，手術(shù)切除用于消融原位4T1-Luc乳腺腫瘤，以提供初始手術(shù)治療。然后，在手術(shù)后7天，給予單劑量7.5mgkg.1DOX、7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的游離多柔比星(DOX)、I-膠束和IS-膠束通過靜脈注射分別提供針對(duì)復(fù)發(fā)腫瘤的術(shù)后化療或熱療（圖4h）。手術(shù)切除后，除PBS作為對(duì)照外，所有治療組均觀察到可忽略不計(jì)的生物發(fā)光，表明原位腫瘤手術(shù)切除成功（圖4i)，但術(shù)后7天有明顯的腫瘤復(fù)發(fā)。與單獨(dú)的手術(shù)切除相比，發(fā)現(xiàn)來自DOX的化學(xué)療法抑制復(fù)發(fā)性腫瘤的生長，然而，腫瘤生長仍然具有侵襲性。重要的是，與僅來自I-膠束的熱療相比，來自IS-膠束的TRPV1阻斷協(xié)同熱療導(dǎo)致了對(duì)復(fù)發(fā)性腫瘤的有效抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)生物發(fā)光信號(hào)和腫瘤重量的減少證明了這一點(diǎn)（圖4i）,j)，進(jìn)一步驗(yàn)證了TRPV1阻斷和熱療之間的明顯協(xié)同作用。還在化療后6小時(shí)或照射后使用組織學(xué)、Ki67和TUNEL染色評(píng)估了IS-膠束對(duì)復(fù)發(fā)性腫瘤的光熱損傷。與I-膠束和DOX相比，光照射下的IS-膠束表現(xiàn)出更嚴(yán)重的腫瘤細(xì)胞損傷、更少的細(xì)胞增殖和增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞凋亡。

在該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，研究人員還觀察了IS-膠束對(duì)源自這些復(fù)發(fā)性乳腺腫瘤模型的轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的影響（圖4k，l）。IS-Micelles明顯抑制了肺部的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，而單獨(dú)使用I-Micelles的熱療顯示出更明顯的肺轉(zhuǎn)移。相反，與PBS組相比，來自DOX的額外化療未能產(chǎn)生任何抗轉(zhuǎn)移作用（圖4k，l）。此外，H&E染色進(jìn)一步驗(yàn)證了IS-膠束的更好和有效的抗轉(zhuǎn)移作用，與來自額外的熱療法或化學(xué)療法的那些相比，在肺中具有不可檢測的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)（圖4k）。這些結(jié)果表明TRPV1阻斷協(xié)同熱療預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的有效性。

?為進(jìn)一步闡明IS-Micelles在光照射下預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同處理后腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，其中PBS組4T1腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照的距離最小在兩個(gè)分離的細(xì)胞群之間，意味著內(nèi)在的轉(zhuǎn)移能力。照射后，與I-膠束相比，ISMicelles導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移減少，表明來自IS-Micelles的TRPV1阻斷和熱療協(xié)同作用明顯減少了細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可能是由于TRPV1阻斷協(xié)同熱療參與轉(zhuǎn)移相關(guān)的EMT通路（圖2e）。因此，IS-膠束通過TRPV1阻斷介導(dǎo)的HSP70上調(diào)和光照下細(xì)胞遷移的抑制，產(chǎn)生更好的抗原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性腫瘤的熱療效力。

圖4.TRPV1阻斷協(xié)同熱療使用IS-Micelles有效抑制原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性TNBC腫瘤

研究結(jié)論：TRPV1阻斷協(xié)同熱療使用IS-Micelles有效抑制原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性TNBC腫瘤。

5.?TRPV1阻斷通過選擇性抑制應(yīng)激性過度表達(dá)的HSP70而具有卓越的安全性，而不會(huì)對(duì)正常組織造成傷害

正常表達(dá)的HSP70作為重要且不可或缺的分子伴侶，可確保準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)折疊，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)以抵御外部刺激。為了研究TRPV1阻斷的安全性，使用抗HSP70一抗和AlexaFluor594偶聯(lián)二抗以及常規(guī)HSP70抑制劑MKT-077和ICG共包封膠束（IM），應(yīng)用免疫熒光染色評(píng)估HSP70在健康組織中的表達(dá)-膠束）作為對(duì)照。簡而言之，IS-Micelles和IM-Micelles分別以5.0mgkg.1的單劑量靜脈注射到健康小鼠體內(nèi)，然后通過CLSM觀察HSP70在不同組織中的表達(dá)。顯然，在注射后24小時(shí)，由于使用MKT-077對(duì)HSP70的非選擇性抑制，IMMicelles在多個(gè)健康組織中引起HSP70表達(dá)顯著降低，而相比之下，IS-Micelles對(duì)所有健康組織中正常表達(dá)的HSP70的影響可忽略不計(jì)對(duì)于PBS組，由于通過TRPV1阻斷介導(dǎo)的HSF1核轉(zhuǎn)位抑制選擇性下調(diào)應(yīng)激性HSP70（圖5a-e），這也通過熒光強(qiáng)度分析得到驗(yàn)證（圖5f）。因此，與IM-Micelles相比，IS-Micelles可能具有更高的安全性，因?yàn)樗鼘?duì)正常表達(dá)的HSP70的影響可以忽略不計(jì)，顯示出安全和選擇性抑制壓力過表達(dá)的HSP70的新興潛力。

為了確認(rèn)安全性，研究人員在注射后3天進(jìn)一步評(píng)估了ISM膠束和IM膠束對(duì)心臟、肝臟和腎臟功能的影響。因此，IS-膠束對(duì)典型的心功能標(biāo)志物（乳酸脫氫酶、LDH和肌酸激酶、CK）、肝功能標(biāo)志物（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、ALT、堿性磷酸酶、ALP和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、AST）和腎功能標(biāo)志物的影響可以忽略不計(jì)（尿素和肌酐）與PBS處理的小鼠相比，而作為對(duì)照的IM-膠束引起明顯的心臟、肝臟和腎臟功能標(biāo)志物變化，因此由于健康組織中正常表達(dá)的HSP70不可避免地受到抑制而導(dǎo)致嚴(yán)重毒性（圖5g），進(jìn)一步證明了TRPV1阻斷介導(dǎo)的選擇性抑制癌細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激性HSP70的良好安全性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證由HSP70抑制引起的并發(fā)毒性，應(yīng)用H&E染色評(píng)估組織學(xué)損傷。明顯地，在IM-Micelles處理的小鼠中觀察到嚴(yán)重的心肌纖維化、肝纖維化和出血、脾核收縮、肺纖維化和嚴(yán)重的腎小管損傷如腎小管擴(kuò)張，而IS-Micelles對(duì)組織學(xué)形態(tài)學(xué)變化的影響可忽略不計(jì)PBS對(duì)照，驗(yàn)證了IS-膠束在同時(shí)提高熱療效力和最小化脫靶毒性方面的良好安全性（圖5h）。此外，由于嚴(yán)重的多器官組織學(xué)損傷，IM-Micelles給藥還導(dǎo)致體重持續(xù)下降，而IS-Micelles對(duì)體重變化的影響可忽略不計(jì)（圖5i），進(jìn)一步證實(shí)了IS-Micelles在體內(nèi)癌癥中的獨(dú)特優(yōu)勢治療。值得注意的是，TRPV1阻斷代替HSP70抑制劑，代表了一種革命性的策略，以最小的脫靶毒性增強(qiáng)熱療效果，源于其對(duì)健康組織中正常表達(dá)的HSP70的干擾可忽略不計(jì)（圖5j）。

圖5.TRPV1阻斷賦予卓越的安全性，而不會(huì)干擾健康組織中正常表達(dá)的HSP70

研究結(jié)論：TRPV1阻斷通過選擇性抑制應(yīng)激性過度表達(dá)的HSP70而具有卓越的安全性，而不會(huì)對(duì)正常組織造成傷害。

6.?TRPV1阻斷協(xié)同熱療對(duì)多種惡性腫瘤產(chǎn)生獨(dú)特的治療效果

受到IS-Micelles通過TRPV1阻斷協(xié)同熱療在TNBC模型中更好的抗腫瘤功效和安全性的啟發(fā)，研究人員進(jìn)一步評(píng)估了它們對(duì)高度侵襲性人類腫瘤模型的治療效力，這些腫瘤模型也高度表達(dá)TRPV1通道，包括HepG2肝腫瘤，MDA-MB-231乳腺腫瘤、HCT-116結(jié)腸直腸腫瘤和PNAC1胰腺腫瘤。首先，使用抗TRPV1一抗和AlexaFluor594標(biāo)記的二抗，應(yīng)用免疫熒光染色來驗(yàn)證這些惡性腫瘤細(xì)胞中TRPV1的表達(dá)。在包括HepG2、MAD-MB-231、HCT-116和PANC1癌細(xì)胞在內(nèi)的不同癌細(xì)胞系中觀察到來自TRPV1通道的顯著紅色熒光，表明TRPV1通道在這些細(xì)胞上大量表達(dá)。在所有這些類型的腫瘤細(xì)胞中，TRPV1通道主要分布在細(xì)胞膜中，如從抗TRPV1抗體（紅色）和細(xì)胞膜探針（DiO，綠色）合并的明顯黃色熒光所示。然后，將IS-Micelles和I-Micelles以7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的單劑量靜脈注射到荷載不同腫瘤模型的小鼠體內(nèi)，隨后進(jìn)行光照（785nm，1.5Wcm.2）在注射后24小時(shí)持續(xù)5分鐘，并測量腫瘤體積以及隨后90天內(nèi)的生存分析（圖6a）。臨床使用的制劑作為對(duì)照也被靜脈注射到攜帶各種腫瘤模型的小鼠中，包括5.0mgkg.1奧沙利鉑加7.5mgkg.1DOX、5.0mgkg.1Doxil和7.5mgkg.1伊立替康。在HepG2、MDA-MB-231和HCT-116腫瘤模型中，I-Micelles或IS-Micelles單獨(dú)顯示對(duì)腫瘤生長的影響可以忽略不計(jì)，在沒有光照的情況下與PBS相似，證明I-的無毒特性膠束和IS-膠束。由于化療細(xì)胞毒性，臨床使用的制劑分別延遲了腫瘤進(jìn)展并延長了攜帶小HepG2、MDA-MB-231和HCT-116腫瘤的小鼠的存活時(shí)間（圖6b、c）。僅來自I-Micelles的熱療只能明顯抑制腫瘤生長并略微延長其生存期，但由于癌細(xì)胞固有的耐熱性，會(huì)發(fā)生明顯的腫瘤復(fù)發(fā)。相反，在曝光后，單次注射IS-膠束可完全根除這些惡性腫瘤，在注射后90天內(nèi)沒有任何復(fù)發(fā)，無論腫瘤模型如何，導(dǎo)致監(jiān)測期內(nèi)100%的存活率（圖6b、c）。然后，研究人員探索了IS-膠束對(duì)大型HCT-116腫瘤模型(250–300mm3)的協(xié)同治療效率。由于TRPV1阻斷選擇性抑制應(yīng)激性HSP70的能力，ISMicelles在光照下明顯延遲了大型HCT-116腫瘤模型的腫瘤生長，最小的腫瘤體積和延長的存活期證明了這一點(diǎn)（圖6d，e）。此外，進(jìn)一步研究了TRPV1阻斷協(xié)同熱療法對(duì)原位HCT-116-Luc腫瘤模型的抗腫瘤功效（圖6a）。顯然，在光照射下接受IS-膠束的小鼠顯示出最低的生物發(fā)光信號(hào)和延長的存活時(shí)間（圖6f-h），驗(yàn)證了更好的抗腫瘤效力。這些結(jié)果證實(shí)了來自IS-膠束的TRPV1阻斷增強(qiáng)針對(duì)大型和原位腫瘤模型的熱療的能力。此外，還研究了IS-膠束對(duì)難治性PANC1胰腺腫瘤的熱治療效力（圖6i）。在沒有光照的情況下，與PBS處理的小鼠相比，I-膠束和IS-膠束給藥對(duì)腫瘤生長的影響可以忽略不計(jì)，進(jìn)一步證明了此類制劑的安全性，而臨床使用的Abraxane/吉西他濱(GEM)制劑則受到部分抑制PANC1胰腺腫瘤的進(jìn)展，但仍顯示出侵襲性腫瘤生長，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的腫瘤重量測量進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖6j，k）。重要的是，與I-膠束相比，IS-膠束在光照下對(duì)腫瘤生長表現(xiàn)出更嚴(yán)重的抑制作用，但仍然受到不完全消融的影響，這可能是由于它們在滲透性差的胰腺癌中的積累和滲透不足（圖6j,k)。

圖6.TRPV1阻斷協(xié)同熱療對(duì)多種惡性腫瘤產(chǎn)生更好的治療效果

研究結(jié)論：TRPV1阻斷是使用IS-膠束協(xié)同熱療的有效方法。

7.?TRPV1阻斷通過HSF1調(diào)節(jié)TGFβ介導(dǎo)的PDAC腫瘤模型纖維化基質(zhì)

緊湊的ECM，如膠原蛋白I和纖連蛋白，構(gòu)成了頑固性腫瘤（如PDAC模型）的病理屏障，通常會(huì)阻礙抗腫瘤化合物的浸潤。有趣的是，HSF1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子也被報(bào)道與TGFβ1調(diào)節(jié)相關(guān)46，后者在CAF增殖、分化和隨后的ECM產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用。為了證明TRPV1阻斷可能通過抑制HSF1介導(dǎo)的TGFβ1上調(diào)來操縱腫瘤基質(zhì)，研究人員因此首先使用免疫熒光染色研究了熱療時(shí)TRPV1阻斷對(duì)PANC02腫瘤細(xì)胞中HSF1分布的影響。顯然，在光照射下用IS-膠束處理的細(xì)胞中觀察到細(xì)胞核中HSF1發(fā)出的綠色熒光可忽略不計(jì)，而作為對(duì)照的I-膠束在光照下顯示出明顯的HSF1核分布，正如高共振驗(yàn)證的那樣。綠色和藍(lán)色熒光的定位（圖7a、b），表明在高表達(dá)TRPV1離子通道的PANC02腫瘤細(xì)胞中，TRPV1阻斷在高溫下抑制HSF1核轉(zhuǎn)位的有效性。然后，進(jìn)行免疫熒光染色以研究來自接受不同處理的小鼠的PANC02腫瘤切片中的HSP70表達(dá)。

與在光照射下用I-膠束處理的抗體相比，IS-膠束導(dǎo)致抗HSP70抗體的紅色熒光明顯下調(diào)，證實(shí)了TRPV1阻斷抑制應(yīng)激性HSP70上調(diào)的能力。之后，進(jìn)一步利用免疫熒光染色評(píng)估照射后24小時(shí)用IS-膠束處理的小鼠的PANC02腫瘤切片的體內(nèi)TGFβ1水平。明顯地，與PBS組相比，ISMicelles單獨(dú)對(duì)TGFβ1表達(dá)的影響可以忽略不計(jì)（圖7c，d），這是由于TRPV1拮抗劑的溶酶體包埋。重要的是，與來自I-Micelles的熱療小鼠相比，IS-Micelles在曝光后導(dǎo)致綠色熒光明顯減少，這合理地歸因于SB705498的大量細(xì)胞質(zhì)易位以有效阻斷TRPV1。顯然，TRPV1阻斷在熱療下調(diào)TGFβ1表達(dá)中起重要作用。

為了進(jìn)一步研究TGFβ1衰減對(duì)CAF的影響，α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)的水平作為量化CAF的兩個(gè)代表性標(biāo)志物，在照射后24小時(shí)使用免疫熒光染色進(jìn)行評(píng)估。IS-Micelles在光照射下僅導(dǎo)致少量α-SMA-和FAPα-陽性成纖維細(xì)胞，如綠色熒光消失所示（圖7e、f），而I-Micelles的熱療顯示來自α-SMA和FAPα的明顯綠色熒光。它表明TRPV1阻斷通過減弱熱療時(shí)TGFβ1的表達(dá)有效地抑制了CAFs的增殖和分化。

由于肌成纖維細(xì)胞CAF是高度纖維化腫瘤基質(zhì)的原因，因此進(jìn)一步應(yīng)用兩種典型ECM蛋白（膠原蛋白I和纖連蛋白）的免疫組織化學(xué)染色來評(píng)估照射后24小時(shí)用IS-膠束處理的小鼠中ECM蛋白的沉積。因此，在光照射下用IS-膠束處理的小鼠的腫瘤切片中觀察到較少的膠原蛋白I和纖連蛋白，與單獨(dú)接受IS-膠束和接受光I-膠束的小鼠相比，棕色明顯減少表明曝光。因此，TRPV1阻斷在防止熱療時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)沉積方面起著關(guān)鍵作用。此外，經(jīng)常用于評(píng)估腫瘤纖維化的馬松三色染色(MTS)也顯示，在光照下用IS-膠束處理后結(jié)締組織增生顯著減少（圖7g，h）。這些結(jié)果證實(shí)了TRPV1阻斷通過減弱TGFβ1水平來調(diào)節(jié)胰腺腫瘤纖維化基質(zhì)的能力。

為了進(jìn)一步證明阻斷HSF1核轉(zhuǎn)位與胰腺腫瘤中TGFβ1衰減之間的相關(guān)性，HSF1A（一種有效的HSF1激動(dòng)劑）在光照射前30分鐘瘤內(nèi)注射到PANC02腫瘤中。顯然，當(dāng)與HSF1A結(jié)合時(shí)，IS-膠束處理導(dǎo)致HSF1在光照下重新轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并導(dǎo)致TGFβ1表達(dá)水平與單獨(dú)熱療的I-膠束相似（圖7i），從而導(dǎo)致減少抑制成纖維細(xì)胞增殖，改善纖維化。因此，TRPV1阻斷介導(dǎo)的HSF1核轉(zhuǎn)位抑制是減輕PDAC模型中腫瘤基質(zhì)的關(guān)鍵過程。隨后，應(yīng)用與血管通透性密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)的免疫熒光染色來驗(yàn)證IS-膠束介導(dǎo)的熱療調(diào)節(jié)腫瘤血管通透性的能力。與單獨(dú)的PBS或IS-膠束相比，I-膠束和IS-膠束導(dǎo)致VEGF-A表達(dá)在光照下明顯增加，證實(shí)熱療能夠增強(qiáng)腫瘤的血管通透性。免疫檢查點(diǎn)阻斷（例如aPD-L1）作為治療癌癥的有效策略出現(xiàn)55-58，但在治療高度纖維化和免疫抑制性腫瘤方面的臨床結(jié)果不佳。

研究人員證明了TRPV1阻斷改善aPD-L1浸潤到在光照射下用IS-膠束處理的PANC02腫瘤。簡而言之，在照射后24小時(shí)，Cy5標(biāo)記的aPD-L1被靜脈注射到攜帶PANC02腫瘤的小鼠體內(nèi)，然后在注射aPD-L1后24小時(shí)對(duì)腫瘤切片進(jìn)行免疫熒光染色（圖7j，k）。顯然，aPD-L1在接受IS-Micelles的小鼠腫瘤中表現(xiàn)出相當(dāng)大的外滲和約100μmin的深度滲透，而在用PBS或I處理的小鼠中僅觀察到aPD-L1在腫瘤中的淺滲透-光照射下的膠束。因此，TRPV1阻斷介導(dǎo)的TGFβ1下調(diào)和熱療誘導(dǎo)的血管通透性增加協(xié)同增強(qiáng)了光觸發(fā)熱療后大分子aPD-L1在通透性差的PDAC模型中的浸潤。

圖7.TRPV1阻斷協(xié)同熱療可降解PANC02腫瘤的高度纖維化腫瘤基質(zhì)，并通過抑制HSF1核易位介導(dǎo)的TGFβ1上調(diào)促進(jìn)aPD-L1浸潤

研究結(jié)論：TRPV1阻斷通過HSF1調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)TGFβ介導(dǎo)的PDAC腫瘤模型纖維化基質(zhì)。

8.?TRPV1阻斷通過減輕免疫抑制和激活免疫反應(yīng)增強(qiáng)針對(duì)小型PDAC模型的熱免疫療法

受aPD-L1在PANC02腫瘤中大量浸潤的啟發(fā)，研究人員進(jìn)一步研究了aPD-L1與IS-膠束對(duì)難治性PANC02腫瘤模型的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤功效。簡而言之，將IS-膠束和I-膠束以7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的劑量靜脈注射到攜帶PANC02腫瘤（50-75mm3）的小鼠中，然后在24小時(shí)光照5分鐘注射后和隨后24小時(shí)后靜脈注射3.0mgkg.1aPD-L1，以及隨后90天的腫瘤體積和存活率測量。8.0mgkg.1Abraxane和35.0mgkg.1GEM的組合也作為臨床使用的對(duì)照進(jìn)行給藥。IS-Micelles/aPD-L1組合完全根除腫瘤，在光照射下沒有任何復(fù)發(fā)，并且所有小鼠在90天內(nèi)存活，而單獨(dú)的IS-Micelles未能完全消融腫瘤，因?yàn)橐苑乐构庹障碌拿庖咛右荨?/p>

同時(shí)，I-Micelles/aPDL1在光照下的聯(lián)合治療也導(dǎo)致腫瘤消融不完全，這是由于aPD-L1的耐熱性和有限浸潤。相比之下，Abraxane/GEM組合仍然導(dǎo)致腫瘤快速生長，所有小鼠在注射后55天內(nèi)死亡，表明臨床標(biāo)準(zhǔn)方案的療效非常有限。IS-膠束介導(dǎo)的TRPV1阻斷可確保對(duì)頑固的PDAC模型產(chǎn)生有效的熱免疫治療效果，且不會(huì)復(fù)發(fā)。

鑒于PDAC模型的高度免疫抑制微環(huán)境通常會(huì)抑制持久的免疫反應(yīng)，研究人員通過監(jiān)測免疫抑制性髓源性抑制細(xì)胞的體內(nèi)浸潤，研究了IS-膠束/aPD-L1組合減輕PANC02腫瘤體內(nèi)免疫抑制的能力使用流式細(xì)胞術(shù)檢測PANC02腫瘤中的(MDSCs)和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)61。PANC02腫瘤本身擁有高比例的MDSCs，而aPD-L1治療僅導(dǎo)致MDSCs頻率略有下降，因?yàn)閍PD-L1無法進(jìn)入PDAC模型。重要的是，IS-Micelles/aPD-L1組合導(dǎo)致PANC02腫瘤中MDSCs頻率明顯降低，這也優(yōu)于單獨(dú)的IS-Micelles或I-Micelles/aPD-L1組合在光照下的效果。

此外，由于免疫抑制細(xì)胞因子TGFβ1的抑制，單獨(dú)的IS-Micelles與光照下的I-Micelles相比也表現(xiàn)出明顯的MDSCs頻率降低，這可以促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的增殖。因此，TRPV1阻斷通過腫瘤中的aPD-L1浸潤和TGFβ1調(diào)節(jié)在抑制MDSCs中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，PANC02腫瘤被發(fā)現(xiàn)含有大量CD11b+F4/80+CD206+TAM（M2樣特征），而與IS-Micelles相比，IS-Micelles/aPD-L1組合導(dǎo)致PANC02腫瘤中的巨噬細(xì)胞在光照射下從M2樣TAM更有效地復(fù)極化為CD11b+F4/80+CD80+TAM（M1樣特征）單獨(dú)或I-膠束/aPD-L1組合，無論光照射如何，表明巨噬細(xì)胞從促腫瘤表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭鼓[瘤表型。相反，Abraxane/GEM組合未能有效地將巨噬細(xì)胞重新極化為抗腫瘤表型。因此，IS-膠束介導(dǎo)的TRPV1阻斷有效地減輕了體內(nèi)免疫抑制，解釋了針對(duì)PDAC模型的協(xié)同熱免疫療法。

為了進(jìn)一步探索IS-無膠束協(xié)同aPD-L1的免疫反應(yīng)，研究人員首先評(píng)估了腫瘤引流淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟，這是抗原特異性T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)和擴(kuò)增的先決條件。ISMicelles/aPD-L1組合導(dǎo)致小鼠淋巴結(jié)中顯著的DCs成熟（CD11c+CD80+CD86+DCs）在光照下，也優(yōu)于單獨(dú)的IS-Micelles或I-Micelles/aPDL1組合。然后，研究人員使用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步監(jiān)測腫瘤浸潤的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。IS-膠束/aPD-L1組合導(dǎo)致腫瘤中CTL（CD45+CD3+CD8+T細(xì)胞）在光照下的頻率明顯提高，與單獨(dú)的IS-膠束或I-膠束/aPD-L1組合分別在光照射下。顯然，TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法可誘導(dǎo)CTL的啟動(dòng)、擴(kuò)增和浸潤，從而激活T細(xì)胞免疫。

另一方面，還使用流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)腫瘤浸潤性自然殺傷(NK)細(xì)胞進(jìn)行了量化。與單獨(dú)的IS-膠束相比，光照射后的IS-膠束/aPD-L1組合導(dǎo)致NK細(xì)胞明顯增加，而不管光暴露或I-膠束/aPD-L1組合，即使在光照射下，表明由于TRPV1阻斷介導(dǎo)的ECM調(diào)節(jié)、熱療介導(dǎo)的溫?zé)岑煼ê蚢PD-L1介導(dǎo)的免疫療法的協(xié)同作用，IS-膠束/aPD-L1組合也會(huì)引起先天免疫激活。因此，TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法通過PDAC模型中攻擊腫瘤的免疫細(xì)胞的浸潤有效觸發(fā)免疫反應(yīng)。

研究人員進(jìn)一步證明了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法是否會(huì)引起長期記憶效應(yīng)以防止腫瘤復(fù)發(fā)。簡而言之，攜帶PANC02腫瘤的小鼠最初在光照射下用IS-Micelles/aPD-L1組合治療，然后在給藥后60天為沒有任何復(fù)發(fā)的存活小鼠進(jìn)一步接種PANC02腫瘤細(xì)胞，隨后通過在接下來的45天內(nèi)測量腫瘤體積。IS-膠束/aPD-L1組合導(dǎo)致對(duì)小鼠腫瘤生長的完全抑制，顯示出明顯的長期記憶效應(yīng)，而幼稚小鼠的腫瘤生長仍然具有侵襲性。為了揭示這種長期記憶效應(yīng)的機(jī)制，研究人員評(píng)估了給藥后60天小鼠脾臟中記憶T細(xì)胞的頻率，它負(fù)責(zé)抵抗腫瘤復(fù)發(fā)。與裸小鼠相比，IS-膠束/aPD-L1組合導(dǎo)致CD44highCD62Llow效應(yīng)記憶T細(xì)胞在光照下增加約2.2倍，從而證實(shí)了長期免疫記憶效應(yīng)來自TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法。

TRPV1阻斷通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境增強(qiáng)對(duì)大型和原位PDAC模型的熱免疫治療為了進(jìn)一步評(píng)估對(duì)大型PANC02胰腺腫瘤模型的協(xié)同抗腫瘤作用，該模型通常具有高度嚴(yán)重的纖維化和免疫抑制，研究人員建立了體積為250的大型PANC02腫瘤模型–300mm3。與其在4T1腫瘤模型和小PANC02腫瘤模型中的滲透以及在大PANC02腫瘤中的適度分布相比，ISMicelles在具有較少血管和纖維化基質(zhì)的大PANC02腫瘤中的滲透相對(duì)受損。這表明IS-膠束甚至能夠滲透到相對(duì)較大和纖維化的腫瘤中，確保隨后TRPV1阻斷與熱療的體內(nèi)協(xié)同作用。如圖8b、c所示，接受臨床標(biāo)準(zhǔn)方案（Abraxane/GEM組合）的小鼠表現(xiàn)出快速腫瘤生長，所有小鼠均在治療后38天死亡。IS-膠束通過TRPV1阻斷協(xié)同熱療顯著延遲了照射后的腫瘤生長。更重要的是，IS-膠束/aPD-L1組合明顯增強(qiáng)了抗腫瘤功效，在照射后7只小鼠中有3只實(shí)現(xiàn)了腫瘤根除，這表明選擇性抑制應(yīng)激性HSP70和調(diào)節(jié)TGFβ通路共同促成了更好的治療效果.同時(shí)，作為對(duì)照的I-膠束/aPD-L1組合顯示出降低的抗腫瘤功效，這合理地歸因于致密ECM導(dǎo)致的耐熱性和aPD-L1浸潤不足（圖8b，c）。然后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究荷載大PANC02腫瘤的小鼠接受不同治療后的體內(nèi)免疫反應(yīng)。由于有效調(diào)節(jié)TGFβ通路11，光照下的IS-膠束導(dǎo)致免疫抑制性MDSC明顯下調(diào)，M2樣TAM明顯復(fù)極化為M1樣TAM，aPD-L1組合進(jìn)一步提高了緩解免疫抑制的效率由于ECM降解介導(dǎo)的aPD-L1浸潤（圖8d-g）。此外，在光照下，接受IS-膠束/aPD-L1組合的小鼠也顯示出明顯的DC成熟，腫瘤浸潤C(jī)TL的明顯改善和NK細(xì)胞，優(yōu)于其他對(duì)照組（圖8h-j）。這些結(jié)果證明了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法能夠引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而解釋了對(duì)大型胰腺腫瘤模型的更好治療效果。

受皮下PANC02胰腺腫瘤模型中免疫抑制的有效緩解和抗腫瘤免疫反應(yīng)的強(qiáng)烈激活的啟發(fā)，研究人員進(jìn)一步探索了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法對(duì)高侵襲性原位PANC02-Luc胰腺腫瘤模型的效力（圖9a）。如圖9b-d所示，接受aPD-L1治療的小鼠表現(xiàn)出侵襲性腫瘤生長，而IS-Micelles/aPD-L1組合在光照射下有效抑制了原位PANC02-Luc腫瘤的生長，僅少數(shù)研究表明生物發(fā)光信號(hào)和明顯延長的存活期，優(yōu)于IS-膠束或I-膠束/aPD-L1組合。這些結(jié)果表明TRPV1阻斷劑通過抑制HSP70和TGFβ自衛(wèi)途徑增強(qiáng)熱免疫療法對(duì)原位PDAC模型的有效性。

隨后，進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究接受不同治療方案的小鼠的體內(nèi)免疫反應(yīng)。與皮下PANC02腫瘤模型相比，在原位PANC02-Luc腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)了更高數(shù)量的免疫抑制性MDSC和M2樣TAM。單獨(dú)的aPD-L1對(duì)免疫抑制性MDSC和M2樣TAM的頻率影響可忽略不計(jì)，而IS-膠束/aPD-L1在光照下導(dǎo)致免疫抑制性MDSC減少2.2倍，M1樣TAM增加5.7倍與M2樣TAM的比率，這比在光照下用I-膠束/aPD-L1或ISM膠束處理的小鼠更有效（圖9e，f）。顯然，TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法通過TGFβ自衛(wèi)通路調(diào)節(jié)和相當(dāng)大的aPD-L1浸潤有效緩解了嚴(yán)重的免疫抑制。此外，aPD-L1本身對(duì)DC成熟的影響可以忽略不計(jì)，而與接受IMicelles/aPD-L1的小鼠相比，IS-Micelles/aPD-L1在光照下導(dǎo)致DC成熟增加1.6倍和1.5倍或IS-Micelles分別在光照下（圖9g），從而解釋了CTL的啟動(dòng)和隨后的浸潤以殺死腫瘤細(xì)胞（圖9h）。此外，光照下的IS-膠束/aPD-L1也導(dǎo)致NK細(xì)胞浸潤最高（圖9i），證實(shí)了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法激活先天免疫的能力。

圖8.使用ISMicelles/aPD-L1組合，TRPV1阻斷增強(qiáng)了針對(duì)皮下PANC02胰腺腫瘤的熱免疫治療功效和免疫反應(yīng)

圖9.使用ISMicelles/aPD-L1組合，TRPV1阻斷增強(qiáng)了針對(duì)原位PANC02-Luc胰腺腫瘤的熱免疫治療功效和免疫反應(yīng)

研究結(jié)論：這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法通過重新訓(xùn)練HSP70和TGFβ自衛(wèi)途徑激活強(qiáng)大的抗腫瘤免疫的能力，最終產(chǎn)生針對(duì)原位PDAC的更好的抗腫瘤效力。

結(jié)論與討論

研究人員開發(fā)了納米顆粒介導(dǎo)的TRPV1阻斷作為調(diào)節(jié)HSF1核轉(zhuǎn)位的高效方法，它選擇性地抑制腫瘤中的HSP和TGFβ自衛(wèi)通路，以實(shí)現(xiàn)針對(duì)高度惡性腫瘤（如難治性胰腺癌）的有效熱免疫療法。研究人員構(gòu)建了TRPV1-KD腫瘤模型闡明TRPV1阻斷能夠抑制Ca2+流入和隨后的HSF1核易位，從而抑制熱療時(shí)壓力過表達(dá)的HSP70，從而通過減輕熱阻增強(qiáng)癌癥熱療。為了實(shí)現(xiàn)TRPV1阻斷和熱療的有效協(xié)同作用，探索了聚合IS-膠束作為基于納米粒子的載體，以實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向同步遞送TRPV1拮抗劑和熱療劑，用于腫瘤選擇性TRPV1阻斷協(xié)同熱療。這些ISM膠束對(duì)原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性TNBC、各種TRPV1陽性惡性人類腫瘤（包括HepG2、MDA-MB-231和PANC1腫瘤）以及小型、大型和原位HCT-116腫瘤模型顯示出明顯的熱療功效。同時(shí)，由于能夠通過從正常表達(dá)的HSP中有效識(shí)別壓力過表達(dá)的HSP來避免脫靶毒性，因此這種TRPV1阻斷劑比傳統(tǒng)的HSP70抑制劑具有更高的安全性。

特別是，研究人員進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到TRPV1阻斷介導(dǎo)的HSF1核轉(zhuǎn)位抑制能夠抑制TGFβ通路，促進(jìn)腫瘤間質(zhì)的有效分解，從而改善抗腫瘤藥物（例如aPD-L1）和免疫細(xì)胞（例如CTL和NK細(xì)胞）轉(zhuǎn)化為腫瘤（圖8k）。因此，IS-Micelles/aPD-L1組合產(chǎn)生了TRPV1阻斷協(xié)同熱免疫療法，通過重振免疫反應(yīng)和緩解免疫抑制，有效抑制高度難治性皮下和原位PDAC腫瘤模型的腫瘤進(jìn)展。研究人員認(rèn)為，TRPV1阻斷代表了一種有效的方法來消除腫瘤的自我防御，以增強(qiáng)針對(duì)各種高度惡性腫瘤的熱免疫療法，并為離子通道阻斷提供了一種有效的癌癥治療方法。