在健康個(gè)體中，巨細(xì)胞病毒(CMV)感染受到CMV特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)的有效控制。然而，免疫功能低下的個(gè)體中CMI的功能障礙會(huì)導(dǎo)致不受控制的CMV復(fù)制和嚴(yán)重的臨床并發(fā)癥。因此，對(duì)CMV特異性CMI的密切監(jiān)測(cè)具有臨床相關(guān)性，并可能使CMV疾病的預(yù)后可靠，并有助于個(gè)性化治療決策。

這項(xiàng)工作的目的是優(yōu)化和技術(shù)驗(yàn)證IFN-γELISpot測(cè)定法，用于對(duì)CMV反應(yīng)性效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、靈敏和可靠的量化。使用Bioreader?5000Eα(BIO-SYS)對(duì)IFN-γ特異性斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

除針對(duì)新冠病毒的Ad5重組蛋白疫苗外，其他病毒的重組蛋白疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗等在進(jìn)入臨床或者臨床前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中，都是選擇的IFN-γELISpot方法評(píng)估疫苗引起的細(xì)胞免疫效應(yīng)。為什么是ELISpot這種方法，不是ELISA?為什么是IFN-γ這個(gè)指標(biāo)，不是其他的細(xì)胞因子？

為什么是ELISpot？

在免疫學(xué)領(lǐng)域中，相關(guān)疾病和疫苗的研究等均是基于體液的免疫應(yīng)答（HumoralMediatedImmuneResponse，HMI）和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（CellMediatedImmuneResponse，CMI）為基礎(chǔ)。在以往的免疫應(yīng)答研究機(jī)制中常使用酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）來(lái)檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或細(xì)胞因子的半衰期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，因此ELISA并不能真實(shí)反映體內(nèi)抗體及細(xì)胞因子的實(shí)際水平。

自1983年，Sedgwick和Czerkinsky結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和ELISA技術(shù)，建立了體外檢測(cè)特異性分泌抗體細(xì)胞（Antibody-SecretingCells，ASCs）和分泌細(xì)胞因子（Cytokine，CK）細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme-LinkedImmunospotAssay，ELISpot），可從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該法及高靈敏度，特異性強(qiáng)，高通量，單細(xì)胞水平，功能性檢測(cè)以及低成本等諸多優(yōu)點(diǎn)于一身，是研究Th1/Th2的反應(yīng)，疫苗研制，病毒感染的檢測(cè)和治療，腫瘤學(xué)，傳染性疾病，自身免疫性疾病和器官移植的理想工具。

為什么是IFN-γ？

IFN-γ作為免疫活性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在誘導(dǎo)抗病毒免疫中起著重要的免疫調(diào)理作用，包括激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxiclymphocyte,CTL）、自然殺傷細(xì)胞（naturalkillercell，NK）細(xì)胞和吞噬細(xì)胞等，而在疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ的水平實(shí)際上反映輔助性T細(xì)胞的活動(dòng)。因此，檢測(cè)IFN-γ的水平就是間接地檢測(cè)輔助性T細(xì)胞活性。目前，檢測(cè)IFN-γ的水平已經(jīng)逐漸代替各種傳統(tǒng)的細(xì)胞免疫檢測(cè)手段，成為檢測(cè)細(xì)胞免疫效果的一種重要方法。

因此，建立IFN-γELISpot檢測(cè)方法，可以作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫的有效方法，目前也已成為疫苗引起的細(xì)胞免疫效應(yīng)評(píng)估的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

關(guān)于Bioreader

由德國(guó)BIO-SYS有限公司研制，擁有專利的雙遠(yuǎn)心照明系統(tǒng)，通過(guò)使用“光度”強(qiáng)度照明和梯度來(lái)區(qū)分真/假點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸出：

總而言之，這種優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)化和用戶友好的 CMV 特異性 IFN-γ ELISpot 測(cè)定滿足用于監(jiān)測(cè) CMV 特異性 CMI 功能的敏感和可靠診斷測(cè)試的所有條件。除了在健康個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證（本研究）外，它還適用于在代表移植前患者的血液透析患者隊(duì)列中評(píng)估 CMV 特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫[?49?]。有必要在免疫功能低下的患者（例如移植受者）中進(jìn)一步驗(yàn)證該測(cè)定法，以確定其是否適合幫助臨床醫(yī)生評(píng)估 CMV 再激活和疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并可能對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療管理。

參考文獻(xiàn)

Barabas, S., Spindler, T., Kiener, R. et al. An optimized IFN-γ ELISpot assay for the sensitive and standardized monitoring of CMV protein-reactive effector cells of cell-mediated immunity. BMC Immunol 18, 14 (2017). https://doi.org/10.1186/s12865-017-0195-y