大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)簡介

1. 代謝途徑和基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚

?1) 全基因組測序，共有4405個開放性閱讀框架；

?2) 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；

?3) 繁殖迅速，培養(yǎng)簡單，操作方便，遺傳穩(wěn)定。

2. 培養(yǎng)周期短

?1) 大腸桿菌繁殖能力強(qiáng)，在營養(yǎng)條件充足時，20~30mins即可繁殖一代；

?2) 大規(guī)模發(fā)酵成本低，具有巨大的生存潛力。

3. 目標(biāo)基因表達(dá)水平高

　表達(dá)水平較一般真核表達(dá)系統(tǒng)高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)總蛋白的5%~30%。

4. 遺傳背景清楚

?1) 對大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究相當(dāng)清楚，已有多種不同的抗藥性、不同營養(yǎng)缺陷型和不同校正突變型的菌株供選擇使用；

?2) 可以根據(jù)不同的載體而選擇不同的菌株。

5. 抗污染能力強(qiáng)，下游工藝簡單，易于控制。

6. 已有大量可供選擇利用的表達(dá)載體，被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體菌。

艾柏森生物大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢

1. 艾柏森生物大腸桿菌可溶性表達(dá)成功率高達(dá)95%；

2. 艾柏森生物可以提供多種大腸桿菌表達(dá)載體，pET28b、pET22b、pGEX-6P-1等。

3. 多種大腸桿菌表達(dá)宿主，標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)菌株BL21，可增強(qiáng)表達(dá)蛋白的菌株T7E，表達(dá)毒性蛋白的C41，增強(qiáng)蛋白可溶性表達(dá)的超低溫菌株Arctic，以及其他經(jīng)過艾柏森生物分子技術(shù)團(tuán)隊改造過的表達(dá)菌株，可以滿足客戶的不同需求。

4. 表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化。通過對表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，很大程度上解決蛋白不表達(dá)和包涵體的問題，如表達(dá)載體與表達(dá)菌株相容性測試、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化、復(fù)性等。

服務(wù)組合

服務(wù)項目 (Service Items)周期（周） Time(weeks)蛋白分析與密碼子優(yōu)化項目開始前完成基因合成2~4載體構(gòu)建1基因表達(dá)純化測試21L發(fā)酵表達(dá)及純化2切標(biāo)簽2大規(guī)模的發(fā)酵與純化以項目需要為準(zhǔn)總計8~10

注：

1）表達(dá)純化測試一般包括2種載體，3種表達(dá)菌株，2個表達(dá)溫度，12個條件的測試，根據(jù)客戶的前期實驗結(jié)果，有可能調(diào)整或縮短試驗周期；

2）我們可提供的備選優(yōu)化條件如下：

表達(dá)載體pET28b\pET32a\pGEX-6p-1\pET22b\pBAD\pTrcHis等表達(dá)菌株Arctic\BL21(DE3)\Origami\Rosetta\T7 Expresss表達(dá)溫度16℃\30℃\37℃

經(jīng)典案例

以某原核蛋白為例:

1. 優(yōu)化表達(dá)體系，包括蘇朱軍、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)劑濃度及培養(yǎng)基。

宿主菌誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)劑培養(yǎng)基T7E，BL21,C41,Arctic30℃/37℃1h/4hIPTG自誘導(dǎo)LB/定制/同位素/自誘導(dǎo)

經(jīng)過3輪優(yōu)化，我們選擇了BL21+pGEX-6p-1組合，并發(fā)現(xiàn)溫度對與目標(biāo)蛋白的表達(dá)影響最大，如圖一

圖一:融合蛋白小試SDS-PAGE分析圖

M:ProteinMarker；：誘導(dǎo)前總蛋白；

2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。

2. 在確定了最優(yōu)表達(dá)條件后，我們對蛋白進(jìn)行了GST瓊脂糖親和層析嘗試純化，如圖二，

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圖二：GST瓊脂糖親和層析純化SDS-PAGE分析圖

M：Protein marker；S：上樣；F：流出；1：20mM GSH洗脫組分；

3. 在確定純化效率可以接受的條件下，我們對蛋白進(jìn)行了大體積發(fā)酵，并最終純化SDS-PAGE分析，如圖三，融合蛋白經(jīng)過純化，SDS-PAGE電泳分析在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，表明目的蛋白成功得到了純化。

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圖三：蛋白最終純化SDS-PAGE分析圖

M：Protein marker；1：目的蛋白

4. 蛋白濃度測定

采用SK3071 非干擾型蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度為1.06mg/mL，待測樣品體積為10μL，結(jié)果如下：

測試1測試2平均值BSA（μg）0.9390.9390.93900.8750.8740.874580.8080.8040.806160.740.7460.743240.6180.6160.617400.8550.8490.852500.8910.8780.8845目的蛋白

圖四：蛋白濃度測定