2022年11月，中國科學(xué)院北京基因組研究所慈維敏團(tuán)隊(duì)和北京大學(xué)第一醫(yī)院李學(xué)松、周利群團(tuán)隊(duì)合作在?Theranostics（IF=11.6）上發(fā)表了關(guān)于尿路上皮癌的研究論文。研究人員對(duì)從 12 名上尿路尿路上皮癌（UTUC）患者處獲得的 13 個(gè)手術(shù)腫瘤組織進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，深入解析了 UTUC 的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，在 UTUC 上發(fā)現(xiàn)了和膀胱尿路上皮癌（UCB）中相似的預(yù)后相關(guān)亞型，闡明了其腫瘤微環(huán)境差異，并利用模擬免疫逃逸的計(jì)算方法預(yù)測(cè)了 IMvigor210?免疫治療隊(duì)列患者治療反應(yīng)，進(jìn)一步為 UC 患者的免疫治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。

該研究基于 10x Genomics 平臺(tái)的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)服務(wù)由博奧晶典提供。

研究背景
尿路上皮癌（UC）是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，膀胱尿路上皮癌（UCB）的發(fā)病率大約占 UCs 的 90-95%，而上尿路尿路上皮癌（UTUC）僅占 UCs 的 5-10%，但其惡性程度顯著高于 UCB。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）能夠影響局部晚期或轉(zhuǎn)移性 UC（mUC）的治療。與 UCB 相比，UTUC 對(duì) ICI 的反應(yīng)率更高，識(shí)別可能有益于 ICI 治療的患者仍然是臨床上主要的挑戰(zhàn)之一。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1、UTUC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了表征腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，研究人員從 12 名 UTUC 患者處收集了 13 個(gè)手術(shù)組織樣本（包括 12 個(gè)原發(fā)性腫瘤和一個(gè)配對(duì)的腫瘤血栓）用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。經(jīng)聚類注釋，共獲得 9 種主要的細(xì)胞類型，包括 T 細(xì)胞、髓系細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、B 細(xì)胞、漿細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞（圖1B-E）。作者發(fā)現(xiàn)肌層浸潤性（MI）腫瘤中的免疫細(xì)胞富集程度更高，而上皮細(xì)胞的比例明顯低于非肌層浸潤性（NMI）腫瘤（圖1F），在大隊(duì)列的 bulk 測(cè)序數(shù)據(jù)中，作者同樣觀察到類似結(jié)果（圖1G）。表明腫瘤細(xì)胞和免疫環(huán)境之間的串?dāng)_可能在塑造肌肉侵襲性方面發(fā)揮作用。

2、MI UTUC 中的管腔和基底亞型

為了更好地理解癌細(xì)胞中可能與免疫細(xì)胞共同發(fā)揮作用的細(xì)胞程序，作者基于拷貝數(shù)變異（inferCNV）分析鑒定出 31,152 個(gè)惡性細(xì)胞，并利用一個(gè)包含 47 個(gè)基因的 BASE47 panel 將惡性細(xì)胞分為管腔和基底亞型（圖2A，B），同時(shí)構(gòu)建了管腔和基底亞型評(píng)分系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)基底亞型評(píng)分與較低的疾病生存率（DSS）相關(guān)，而管腔亞型評(píng)分與高 DSS 相關(guān)（圖2C）。差異基因分析識(shí)別了管腔和基底亞型間的 521 個(gè)差異基因（圖2D，E），GO 富集分析結(jié)果表明管腔亞型與上皮發(fā)育相關(guān)，基底亞型與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)（圖2F)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示與管腔亞型相比，基底亞型的髓樣趨化特征和免疫逃逸基因表達(dá)上調(diào)，從而富集了參與調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞分化的基因（圖2G），同時(shí)基底亞型比管腔亞型具有更強(qiáng)的免疫逃逸表型。

3、基底亞型中富集免疫抑制巨噬細(xì)胞群，與較差的臨床預(yù)后相關(guān)

作者進(jìn)一步對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行了亞群分析。巨噬細(xì)胞為髓系中主導(dǎo)的細(xì)胞類型并被分為 4 個(gè)亞群（圖3A-C），其中亞群 Macro-C3 顯著富集于基底亞型中（圖3D），并表達(dá) CD8+T 細(xì)胞招募相關(guān)基因和免疫檢查點(diǎn)及逃逸基因 (圖3B)，同時(shí)表現(xiàn)出誘導(dǎo)免疫耐受基因的表達(dá)上調(diào)（圖3E）?；?Macro-C3 的標(biāo)記基因，作者開發(fā)了 Macro-C3 特征評(píng)分（圖3F），用于臨床意義的評(píng)估。對(duì)日本 UTUC 隊(duì)列數(shù)據(jù)中特征的評(píng)估結(jié)果顯示，基底亞型的 Macro-C3 特征得分顯著高于 NMI 和管腔亞型（圖3G），同時(shí)較高的 Macro-C3 特征得分與 DSS 和無進(jìn)展生存率（PFS）的降低顯著相關(guān)（圖3H）。表明基底 UTUC 中巨噬細(xì)胞的免疫抑制作用增強(qiáng)。

4、基底亞型中的耗竭 T 細(xì)胞的擴(kuò)張

T/NK 細(xì)胞被進(jìn)一步分為 8 個(gè)亞群，包含 1 個(gè) Na?ve T、2 個(gè) CD4+?T、3 個(gè) CD8+?T 及 2 個(gè) NK 亞群（圖4A-C）。作者發(fā)現(xiàn)基底型中 na?ve T 細(xì)胞的相對(duì)比例顯著低于 NMI 和管腔型（圖4D），而耗竭型 CD8+?T 細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的富集（圖4E），提示基底型腫瘤微環(huán)境中 CD8+?T 細(xì)胞功能障礙和免疫耗竭增加。TCGA-BLCA 和日本 UTUC 隊(duì)列數(shù)據(jù)集的解卷積分析結(jié)果顯示，耗竭 CD8+?T 細(xì)胞的升高與 UCB 和 UTUC 患者的不良生存率顯著相關(guān)（圖4F）。表明基底型 UTUC 中的免疫監(jiān)視減弱。

5、髓系和淋系間的相互作用形成了基底型 UTUC 的免疫抑制微環(huán)境

鑒于基底亞型中惡性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和 T 細(xì)胞共有免疫抑制表型，作者推測(cè)不同的細(xì)胞群間參與復(fù)雜的串?dāng)_。細(xì)胞互作分析結(jié)果顯示在髓系細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞間具有最廣泛的交流，并通過?MIF?和?CD74?介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)（圖5A，B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CD8+?T 細(xì)胞豐度及巨噬細(xì)胞來源的?CXCL?表達(dá)之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5C），同時(shí)?CXCL?及其受體介導(dǎo)了基底亞型中巨噬細(xì)胞及 CD8+?T 細(xì)胞間的強(qiáng)烈互作（圖5B）。多色免疫熒光染色顯示基底亞型中巨噬細(xì)胞和 CD8+?T 細(xì)胞的共定位（圖5D），表明巨噬細(xì)胞可能在 CD8+?T 細(xì)胞向 UTUC 的募集中發(fā)揮重要作用。作者接下來探討了募集的 CD8+?T 細(xì)胞耗竭的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)免疫抑制巨噬細(xì)胞通過廣泛的受配體對(duì)作用驅(qū)動(dòng) CD8+?T 細(xì)胞的耗竭，日本 UTUC 隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種關(guān)聯(lián)（圖5E-H）。表明 UTUC 中髓系和淋巴細(xì)胞之間存在著強(qiáng)烈的相互作用，同時(shí)上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和 T 淋巴細(xì)胞間合作塑造基底亞型中的免疫抑制微環(huán)境及耗竭 T 淋巴細(xì)胞的浸潤（圖5I）。

6、Macro-C3 評(píng)分預(yù)測(cè) mUC 的免疫治療反應(yīng)

為了評(píng)估對(duì)免疫治療的反應(yīng)和耐藥的決定因素，作者使用 IMvigor210 免疫治療隊(duì)列來研究 mUC 中阻斷 PD-L1 的臨床活性。相較于管腔亞型及 NMI，基底亞型顯示出更明顯的炎癥表型（圖6A，B）。免疫細(xì)胞中 PD-L1 的表達(dá)和 Macro-C3 評(píng)分與 NMI 和管腔亞型的應(yīng)答相關(guān)，但與基底亞型無關(guān)（圖6C）。巨噬細(xì)胞和 CD8+?T 細(xì)胞間互作分析表明這兩種細(xì)胞間存在多種顯著的免疫抑制相互作用導(dǎo)致了基底亞型的免疫逃逸（圖6D）。此外，免疫抑制的 Macro-C3 標(biāo)志基因和 T 細(xì)胞毒性基因的表達(dá)隨著基底亞型標(biāo)記的增強(qiáng)而增加（圖6E）。由此，作者開發(fā)了使用 Macro-C3 評(píng)分和 T 細(xì)胞毒性評(píng)分來模擬免疫逃逸程度的計(jì)算方法，預(yù)測(cè)了基底評(píng)分較低的 mUC 患者接受 PD-L1 抑制劑治療的反應(yīng)（圖6F-H）。

研究結(jié)論

研究利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示了?UTUC?中存在和 UCB 中相似的預(yù)后相關(guān)的基底和管腔亞型，基底亞型中富集免疫抑制的巨噬細(xì)胞和耗竭型的?CD8+?T?細(xì)胞，并且?CD8+?T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤來源的上皮細(xì)胞之間的串?dāng)_形成了基底亞型免疫抑制微環(huán)境。通過整合 IMvigor210?免疫治療隊(duì)列，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種模擬免疫逃逸的計(jì)算方法，預(yù)測(cè)了基底評(píng)分較低的 mUC 患者接受 PD-L1 抑制劑治療的治療反應(yīng)。研究結(jié)果為提高 UC 患者抗腫瘤免疫提供新的治療靶點(diǎn)，為不同 UC 亞型提供新的預(yù)后及治療反應(yīng)評(píng)估策略提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Liang Y, Tan Y, Guan B, et al. Single-cell atlases link macrophages and CD8+?T-cell subpopulations to disease progression and immunotherapy response in urothelial carcinoma.?Theranostics. 2022;12(18):7745-7759. doi:10.7150/thno.77281.