利用病毒載體是一種高效的將外源遺傳信息遞送入靶細(xì)胞的方法。

制備重組病毒載體通常需要在大腸桿菌中擴(kuò)增攜帶目的基因的質(zhì)粒DNA，然后將這些質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞。重組病毒從這些包裝細(xì)胞中產(chǎn)生，然后經(jīng)過分離純化、濃縮等步驟獲得病毒原液。

然而，這些復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟無疑增加了實(shí)驗(yàn)的難度，病毒包裝實(shí)驗(yàn)常常會(huì)因?yàn)檩d體設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染步驟，以及轉(zhuǎn)基因毒性等步驟發(fā)生問題而導(dǎo)致失敗。

在這里我們總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)，相信可以幫助大家在進(jìn)行病毒包裝時(shí)盡可能獲得高滴度的病毒。

01 滴度檢測(cè)差異

從包裝細(xì)胞分離出病毒后，為確保高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，檢測(cè)病毒滴度以確定病毒產(chǎn)量成為一個(gè)不可或缺的步驟。檢測(cè)病毒滴度有很多種方法，而使用哪一種方法則需要根據(jù)實(shí)際情景綜合考慮。

值得注意的是，選擇正確的滴度測(cè)定方式，要根據(jù)病毒類型和特性來進(jìn)行判定，需在物理滴度（病毒數(shù)量）與功能滴度（生物學(xué)功能水平）之間作出抉擇，或者二者兼而有之。

對(duì)于不同種類的病毒，不同類型的病毒可使用不同的方法檢測(cè)，下面是常見的幾種病毒的滴度測(cè)定方法。

每種滴度檢測(cè)方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，使用哪一種方法與可利用的實(shí)驗(yàn)資源有關(guān)。滴度檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生差異也是很常見的現(xiàn)象，這是因?yàn)椴煌姆椒ā⒛Ｐ?、試劑以及設(shè)備均有可能帶來不同的測(cè)定結(jié)果。此外，病毒降解后也會(huì)導(dǎo)致滴度降低。

02 檢查載體問題

病毒包裝滴度低的情況可能源自上游多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的問題。針對(duì)此類情況，首先要確保載體設(shè)計(jì)是正確的。比如，當(dāng)克隆至載體的轉(zhuǎn)基因超出了載體骨架推薦的容量限制，又或者包含一段橫跨數(shù)百或者更多堿基的高GC含量（>70% GC%）序列，都會(huì)降低病毒滴度。

對(duì)于AAV載體來說，其反向末端重復(fù)序列（ITR）是一種GC富集序列。當(dāng)ITR發(fā)生序列錯(cuò)誤會(huì)直接影響其復(fù)制，進(jìn)而影響病毒滴度。確保ITR的完整性對(duì)于獲得高滴度的AAV病毒包裝具有重要作用。

另外，大家還要確保自己使用了合適的包裝輔助質(zhì)粒和包裝細(xì)胞。比如，二代慢病毒的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體不可被用于三代慢病毒包裝體系。其次，包裝細(xì)胞必須可以被轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和其它輔助質(zhì)粒有效轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞表現(xiàn)出衰老化時(shí)，會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，從而最終導(dǎo)致病毒包裝滴度變低。

病毒的最后收集步驟也是重要的一步：需要保證在合適的時(shí)間點(diǎn)和條件下收集病毒（考慮收集上清、細(xì)胞沉淀、以及兩者均收集）。

03 毒性基因

在排除以上因素后，如果病毒滴度仍然偏低，建議考慮載體攜帶的轉(zhuǎn)基因的毒性影響。實(shí)際上，目前已知有相當(dāng)一部分基因是對(duì)包裝細(xì)胞具有毒性的，比如凋亡類型的基因Bax、GSDME，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子類型的基因BABAM2、NEK1，以及與細(xì)胞增殖調(diào)控相關(guān)的基因FRL1、Foxn1。

多項(xiàng)研究表明，當(dāng)這些基因被克隆到轉(zhuǎn)移載體并轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的包裝細(xì)胞時(shí)，由于細(xì)胞毒性的影響，病毒包裝實(shí)驗(yàn)可能無法獲得高滴度的病毒（McClean et al., 2009 & Janus et al., 2020）。

另外，一些與CRISPRa系統(tǒng)相關(guān)的基因（如p65/HSF1基因）也被發(fā)現(xiàn)可能減少病毒產(chǎn)量。
如果不得不使用具有毒性的基因，一個(gè)最直接的改善方式是更換使用強(qiáng)度更弱的啟動(dòng)子。

下表展示了不同強(qiáng)度啟動(dòng)子條件下包裝含有Foxn1基因的AAV病毒。數(shù)據(jù)表明，使用強(qiáng)度更弱的啟動(dòng)子可以增加病毒產(chǎn)量，使其達(dá)到了采用同等啟動(dòng)子的EGFP轉(zhuǎn)基因的病毒包裝效果。

此外，也可以運(yùn)用誘導(dǎo)型或者組織特異性啟動(dòng)子讓轉(zhuǎn)基因在包裝細(xì)胞中維持低的表達(dá)水平。如果在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的攜帶強(qiáng)啟動(dòng)子是必須的，則可以通過改造包裝細(xì)胞來抑制轉(zhuǎn)基因在包裝細(xì)胞中的活性。

對(duì)于shRNA載體，一種常用的方法是通過在包裝細(xì)胞中抑制DICER的活性降低shRNA的活性。這樣的方式多種多樣，比如說將毒性基因分解成多個(gè)片段克隆至轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并且特別適用于在AAV中克隆大片段的轉(zhuǎn)基因。該方法需要精心設(shè)計(jì)載體，一般在沒有其它方法可用時(shí)才會(huì)使用。

病毒載體的優(yōu)勢(shì)在于可以更容易地對(duì)多種類型的細(xì)胞進(jìn)行基因遞送，然而對(duì)于不同的應(yīng)用和靶細(xì)胞，我們想要取得足夠高的病毒滴度仍然有一些挑戰(zhàn)。

除了提及的合適的載體設(shè)計(jì)和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，調(diào)整轉(zhuǎn)移載體上的啟動(dòng)子類型或者包裝細(xì)胞中的下游靶點(diǎn)則常被用于減少毒性基因的影響。

云舟生物對(duì)于病毒載體的設(shè)計(jì)的每一個(gè)關(guān)鍵步驟均有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。下表展示了我們已發(fā)現(xiàn)容易導(dǎo)致低病毒滴度的基因類型。對(duì)于這些基因的病毒包裝，建議采用特殊的或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

參考文獻(xiàn)
1. Janus P, Toma-Jonik A, Vydra N, et al. Pro-death signaling of cytoprotective heat shock factor 1: upregulation of NOXA leading to apoptosis in heat-sensitive cells. Cell Death Differ. 2020;27(7):2280-2292.2. McLean JE, Datan E, Matassov D, Zakeri ZF. Lack of Bax prevents influenza A virus-induced apoptosis and causes diminished viral replication. J Virol. 2009;83(16):8233-8246.3. Sena-Esteves M, Gao G. Titration of Lentivirus Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(4):10.1101/pdb.prot095695.4. Tiscornia G, Singer O, Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 2006;1(1):241-245.5. Wang F, Cui X, Wang M, Xiao W, Xu R. A reliable and feasible qPCR strategy for titrating AAV vectors. Med Sci Monit Basic Res. 2013;19:187-193. Weaver LS, Kadan MJ. Evaluation of adenoviral vectors by flow cytometry. Methods. 2000;21(3):297-312.

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云舟生物科技（廣州）股份有限公司創(chuàng)建于2014年，是世界知名分子生物學(xué)家藍(lán)田博士創(chuàng)辦的基因遞送領(lǐng)軍企業(yè)，全球范圍內(nèi)設(shè)有10余家分公司和辦事處。云舟生物獨(dú)創(chuàng)“VectorBuilder”平臺(tái)（即“載體家”），開啟了定制化基因載體商品化時(shí)代，目前已累計(jì)向全球90多個(gè)國家和地區(qū)超過4000家科研院校和制藥公司，提供超過120萬個(gè)基因遞送解決方案，每年超過30萬個(gè)項(xiàng)目投入生產(chǎn)，成果被上千篇Science、Nature、Cell等全球頂尖科研期刊廣泛引用。

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