多系統(tǒng)萎縮 （MSA） 是一種散發(fā)的、多見于成人的進展性神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征表現(xiàn)為自主神經(jīng)衰竭、帕金森綜合征和共濟失調的各種組合。MSA 是一種α突觸核蛋白相關疾病，其神經(jīng)病理學標志是由錯誤折疊的α-突觸核蛋白組成的神經(jīng)膠質細胞質包涵體。紋狀體黑質系統(tǒng)和橄欖腦橋小腦系統(tǒng)中的選擇性萎縮和神經(jīng)元丟失是MSA-帕金森病型和MSA-小腦型兩種主要運動表型的基礎。

腺相關病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一類細小病毒，基因組為單鏈DNA，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。通常需要腺病毒或皰疹病毒幫助其在體內復制擴增。AAV相比于其他病毒載體具有表達時間長、擴散性強、特異性強、安全性高、免疫原性低、高穩(wěn)定性等特點。

穩(wěn)轉株即穩(wěn)定表達的細胞株，指基于某一細胞系構建的持續(xù)過表達或干擾某特定基因的細胞系。通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體被轉染至宿主細胞并整合到其染色體中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去，再用載體中所含抗性基因進行篩選。

試驗流程：

1、試劑耗材

AAV-MBP-hm-α-Syn病毒、重組Anti-Alpha-synuclein (phospho S129)、培養(yǎng)基、血清、PBS、胰酶、Poly brene、培養(yǎng)瓶、24孔板。

2、MBP病毒轉染

1) 培養(yǎng)OLN-93（大鼠少突膠質前體細胞），培養(yǎng)體系為DMEM+10%FBS；

2) 確定MOI值，可通過查閱文獻確定慢病毒在目標細胞系中的MOI值也可參考查閱得到的數(shù)據(jù)，設計梯度實驗，摸索最適MOI；

3) 將細胞鋪板、計數(shù)，將需要的細胞量接種于合適的孔板中；

4) 待細胞生長至70-80%進行轉染，通過接種的細胞量及預實驗得來的MOI來計算添加的病毒體積，并感染病毒；

5) 轉染48h后撤病毒，觀察轉染效率，顯微鏡拍照。

（注：轉染過程中，細胞免疫力較低，容易污染。）

小結：通過設置病毒梯度，OLN-93與MBP病毒共同培養(yǎng)48h，我們發(fā)現(xiàn)7.0μM的病毒轉染效率最好。

3、pSer129染色

重組Anti-Alpha-synuclein (phospho S129)：該抗體檢測在Ser129上磷酸化的α突觸核蛋白，參與多巴胺釋放和運輸?shù)恼{節(jié)，誘導微管相關蛋白tau的纖顫化，降低神經(jīng)元對各種凋亡刺激的反應，導致半胱天冬酶-3激活減少。

小結：通過轉染MBP病毒建立穩(wěn)轉細胞株：與Control組相比，0.1μM組、1.0μM、7.0μM組陽性細胞率較低，有極顯著差異，具有統(tǒng)計學意義(p<0.001)。

北京愛思益普生物科技股份有限公司專注于從靶點發(fā)現(xiàn)驗證、先導化合物篩選、優(yōu)化到臨床前候選分子階段的創(chuàng)新藥一體化生物學服務平臺，覆蓋在腫瘤，免疫，心血管，中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病領域，整合蛋白科學、酶學、細胞學、體內外藥物代謝動力學、藥理學等平臺，支持創(chuàng)新藥物研發(fā)項目，支持基礎科研與臨床轉化醫(yī)學業(yè)務。