8+中性粒細胞+分型+單細胞富
急性胰腺炎是一種全球常見的危重急性胃腸疾病，患病率逐漸增加。然而，外周血基因表達模式尚未完全分析。此外，尚未研究2019冠狀病毒?。–OVID-19）引起的急性胰腺炎的機制。
1. 鑒定具有顯著通路和中心基因的差異表達基因
GSE194331數(shù)據(jù)集包括了來自AP患者外周血的mRNA表達數(shù)據(jù)，其中疾病組包括57個輕度胰腺炎樣本、20個中度重癥胰腺炎樣本和10個重度胰腺炎樣本，健康對照組包括32個樣本。通過DEseq2軟件包進行差異表達分析(logFC >1, p < 0.05) (圖1A)，共鑒定出1,064個差異表達基因(DEGs) 。如圖1B所示，前50個上調(diào)和下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄表達能夠區(qū)分大部分疾病樣本，尤其是重度樣本，與健康樣本有所區(qū)別(圖1B)。“中性粒細胞顆粒溶解”是富集術語條形圖中的一個顯著通路(圖1C)。“應激反應”是基因本體分析中最顯著的術語(圖1D)。這些術語強調(diào)了中性粒細胞在AP發(fā)生中的關鍵價值。PPI分析表明存在一些具有顯著密度的模塊，包括一個包含IL-1R1、IL-1RN、IL-1R2、IL-10和MMP1的模塊，一個包含HIST家族基因的模塊，以及另一個包含MAPK相關基因的模塊(圖1E)。IL-10、IL-6、OSM、MMP9、MMP1、LCN2、HGF、TIMP1、IL1B和HIST1H4F被確定為前10個富集基因（圖1F、G）。
圖1
2. 通過WGCNA鑒定急性胰腺炎中的關鍵基因模塊
為了進一步闡明正常外周血和AP的不同亞型（MAP、MSAP和SAP）之間的潛在機制和基因模塊，作者在批次歸一化后對兩個數(shù)據(jù)集的疾病樣本進行了WGCNA分析（圖2A）。如圖2B、C所示，所有樣本都被納入分析，最佳向量冪設置為11。棕色模塊和青色模塊是與AP嚴重程度呈負相關和正相關的兩個顯著基因模塊（圖2D）。其他基因模塊具有緊密的基因調(diào)控網(wǎng)絡（圖5C）。WGCNA的結(jié)果表明，棕色模塊和青色模塊中的基因共同調(diào)控AP的生物過程。
圖2 WGCNA結(jié)果顯示急性胰腺炎的不同亞型
3. WGCNA結(jié)果顯示急性胰腺炎的不同亞型
為了進一步研究已確定模塊中的基因功能和重要的KEGG通路，作者使用了Metascape數(shù)據(jù)庫。與T細胞激活和病毒感染相關的“RNA代謝”通路在藍綠色模塊中顯著富集。藍綠色模塊的通路網(wǎng)絡顯示這三個相關通路是獨立作用的（圖3A）。此外，“中性粒細胞顆粒溶解”，“炎癥反應”和“對細菌的反應”在棕色模塊中顯著富集。藍綠色模塊的通路網(wǎng)絡顯示這些相關通路是協(xié)同作用的（圖3B）。
圖3
4. 急性胰腺炎中免疫細胞亞型和可靠生物標志物的鑒定
在免疫細胞類型浸潤分析中，結(jié)果顯示隨著AP的進展，外周血DCs、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞呈逐漸增加的趨勢，而B細胞、CD4 T細胞、CD8 T細胞、Treg細胞、輔助T細胞（Th細胞）、Th1細胞、Th2細胞和Tfh細胞呈逐漸減少的趨勢（圖4A）。然后，在重癥AP組（MSAP&SAP）和對照組（健康對照組和MAP）之間進行了隨機森林分析（圖4B）。列出了前30個基因（圖4C）。在這些基因中，有10個基因具有顯著的診斷價值（AUC >0.8），包括S100A6、S100A9、S100A12、CD63、ITK、CD5、ANXA3、KLF12、TRABD2A和CCR7（圖4D）。
圖4
5. 驗證可靠的生物標志物以監(jiān)測急性胰腺炎的嚴重程度
如圖5A所示，所有八個基因在健康對照組、MAP組和MSAP&SAP組之間均顯示出顯著差異。由于檢測誤差率較低，表達較高的基因更適合作為診斷因子。根據(jù)這一標準，篩選出三個具有顯著診斷價值的基因（最小相對表達量>500），包括S100A6、S100A9和S100A12。為了測試這些基因在AP嚴重程度鑒定中的穩(wěn)定性，收集了28個外周血樣本，并檢測了這些基因的相對表達量。根據(jù)AP的嚴重程度（MSAP&SAP組和MAP組），在所有基因的表達值中發(fā)現(xiàn)了顯著差異（圖5B）。ROC分析也驗證了這些基因在SAP和MAP之間具有顯著的診斷價值（圖5C）。
圖5
6. 急性胰腺炎和COVID-19之間常見生物過程和關鍵外周血細胞類型的鑒定
為了進一步探索COVID-19引起的胰腺炎中的常見生物過程和關鍵細胞類型，本研究使用了GSE152418數(shù)據(jù)集。通過DEseq2軟件包鑒定出了1494個差異表達基因。在AP和COVID-19患者的外周血中，共鑒定出161個上調(diào)基因和12個下調(diào)基因（圖6A）。在這些共同基因的KEGG通路分析中，“中性粒細胞去顆?；憋@著富集（圖6B）。在網(wǎng)絡的中心角色中，發(fā)現(xiàn)了“中性粒細胞去顆粒化”通路具有最顯著的價值（圖6C、D）。
圖6
7. 單細胞數(shù)據(jù)集中中性粒細胞類型的鑒定
正如介紹中所提到的，一項先前的研究表明，COVID-19引起的敗血癥有可能誘發(fā)和加速AP（5-8）。然而，關于細菌引起的敗血癥，另一種常見的敗血癥原因，目前沒有相關報告。根據(jù)作者上面的分析，中性粒細胞可能是COVID-19感染和外周血中AP之間的一個重要亞型共同致病因子。因此，作者接下來通過分析單細胞測序數(shù)據(jù)來研究細菌引起的敗血癥和COVID引起的敗血癥之間中性粒細胞的變化，以確定COVID-19引起的AP的外周血致病因子。如圖7A所示，在接下來的步驟中選擇0.05作為分辨率。1、6和9組被確定為中性粒細胞（圖7B-D）。
圖7
8. 不同中性粒細胞類型的鑒定
然后，被鑒定出來的中性粒細胞被篩選并提取進行以下分析。鑒定出了五個中性粒細胞亞群（圖8A-C）。如圖8D所示，0組在COVID-19組中顯著上調(diào)，3組在細菌引起的敗血癥中顯著增加。每組篩選出了前10個基因（圖8E）。重要的是，0組中的前列基因與IFN反應性表型和炎癥有關。3組和4組更有可能表現(xiàn)出增殖表型。中性粒細胞脫顆粒與中性粒細胞的激活密切相關。中性粒細胞脫顆粒的標記基因包括MPO、ELANE、CAMP、CYBA、MMP8和MMP25。如圖8F所示，中性粒細胞脫顆粒的標記基因在0組中顯著上調(diào)?？傊?，0組代表一種成熟激活的中性粒細胞亞型，主要富集在COVID-19引起的敗血癥中，具有高表達的IFN相關基因。
圖8
9. 零型中性粒細胞是急性胰腺炎相關的潛在致病亞型，與干擾素分泌有關，并在急性胰腺炎患者的外周血中上調(diào)
最后，在單細胞通路分析的驗證后，將0組確定為與干擾素相關的組（圖9A、B）。偽時序位點分析顯示，5組代表敗血癥中中性粒細胞的原始和非活化表型，而0組的進化軌跡與其他成熟中性粒細胞不同（圖9C、D）。然后，在0組中發(fā)現(xiàn)了一些常見的與代謝相關的通路，包括“脂肪酸降解”、“α-亞麻酸代謝”、“硫代謝”和“脂肪酸生物合成”（圖9E、F）。最后，為了進一步驗證已確定的與干擾素相關的中性粒細胞致病亞型，使用cibersoftx軟件估計了單細胞測序數(shù)據(jù)中所有中性粒細胞中已確定亞型的比例，包括AP患者和健康對照組（基于前一個GEO批量測序數(shù)據(jù)集：GSE194331）。該亞型在健康對照組的外周血中幾乎為0，在AP患者的外周血中顯著上調(diào)，并隨著疾病嚴重程度的增加而增加（圖9G）。
圖9
總結(jié)
總之，作者首次對來自超過87個人類血液樣本的測序數(shù)據(jù)進行了WGCNA分析，將其分為健康組、MAP組、MSAP組和SAP組，并確定了與AP嚴重程度相關的兩個功能基因模塊。這是首個使用WGCNA在AP的外周血中鑒定基因生物標志物，并通過確定嗜中性粒細胞中的特定功能亞群來提出COVID-19引起胰腺炎的潛在發(fā)病機制的研究。這些發(fā)現(xiàn)有助于急性胰腺炎的臨床嚴重程度診斷和基礎研究
