簡(jiǎn)介：

鈣成像是一項(xiàng)非常有用的技術(shù)。它研究鈣離子在正常工作的神經(jīng)元中的各種功能。鈣離子能產(chǎn)生許多控制細(xì)胞關(guān)鍵功能的胞內(nèi)信號(hào)，如神經(jīng)遞質(zhì)從胞囊的釋放。鈣成像技術(shù)能直接測(cè)量神經(jīng)元和神經(jīng)元組織中動(dòng)態(tài)的鈣流動(dòng)。本短片概要介紹了鈣指示劑染料的工作原理和基本操作步驟，最后討論了該技術(shù)的一些實(shí)際應(yīng)用。

Biochemistry of Calcium Indicator Dyes

首先讓我們看看鈣指示劑原理的生化原理，鈣指示劑染料是修飾過(guò)的螯合劑分子，如Fura-2，它由兩個(gè)主要成分組成，首先是螯合位點(diǎn)，能選擇性結(jié)合鈣離子；其次是熒光位點(diǎn)，當(dāng)用激發(fā)波長(zhǎng)的紫外光照射時(shí)，能發(fā)射特定波長(zhǎng)的光。鈣與染料的結(jié)合能改變?nèi)玖系奶匦?，從而提供了一種動(dòng)態(tài)檢測(cè)鈣濃度變化的方法， 即通過(guò)神經(jīng)元在兩個(gè)不同激發(fā)波長(zhǎng)下所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度差異來(lái)判斷。

大多數(shù)鈣指示劑染料經(jīng)過(guò)了進(jìn)一步的修飾，已使其已于穿透細(xì)胞膜，并被添加在神經(jīng)元的培養(yǎng)液或注射到腦組織中用于成體動(dòng)物的研究，依照其有無(wú)結(jié)合鈣離子，一些染料具有雙激發(fā)或雙發(fā)射的特性。例如，F(xiàn)ura-2染料在有或無(wú)鈣離子結(jié)合時(shí)有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，通過(guò)計(jì)算它在兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)發(fā)光強(qiáng)度的比值，就可以更精確地判斷鈣離子的濃度。像Fura-2這種雙激發(fā)或者雙發(fā)射的染料，被稱為熒光比例型鈣指示劑；也有單一激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的非熒光比例型染料，但他們更容易被光漂白，且長(zhǎng)時(shí)間曝光會(huì)使其熒光減低或消失。實(shí)驗(yàn)前使用染料的一個(gè)關(guān)鍵步驟是對(duì)已知鈣離子濃度的溶液中，染料的熒光測(cè)量值進(jìn)行校準(zhǔn)，這時(shí)科學(xué)家們可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的發(fā)射熒光強(qiáng)度來(lái)準(zhǔn)確判斷胞內(nèi)鈣離子的濃度。

Procedures for Calcium Imaging in Neurons

現(xiàn)在我們已經(jīng)知道了鈣指示劑是如何工作的，現(xiàn)在讓我們來(lái)探討如何在培養(yǎng)的神經(jīng)元上進(jìn)行鈣成像檢測(cè)。

首先，準(zhǔn)備選定的鈣指示劑染料，如Fura-2，并將它與添加的生理溶液混合，漩渦震蕩溶液，以保證混合充分，充分混合后將其轉(zhuǎn)移一個(gè)培養(yǎng)皿中。現(xiàn)在將培養(yǎng)有神經(jīng)元的蓋玻片放置在含染料溶液的培養(yǎng)皿中，接下來(lái)在適當(dāng)?shù)臏囟认卤芄夥跤窠?jīng)元至所需的時(shí)間。這里是37攝氏度，30分鐘。

孵育結(jié)束后，將蓋玻片轉(zhuǎn)移至不含染料的培養(yǎng)皿，下一步是將蓋玻片安裝在顯微鏡的成像室上，一旦安裝好，就連接上灌注系統(tǒng)的輸入導(dǎo)管，并慢慢地用溶液填充腔室；將腔室固定在顯微鏡的載物臺(tái)上，并安裝輸出灌注導(dǎo)管，確保溶液在整個(gè)灌注系統(tǒng)連續(xù)流動(dòng)?，F(xiàn)在，顯微鏡平臺(tái)準(zhǔn)備好了，用可見(jiàn)光聚焦神經(jīng)元，通過(guò)在340或380nm的波長(zhǎng)下照射細(xì)胞來(lái)測(cè)試染料。及得到用Fura-2染料時(shí)，未激活的神經(jīng)元在380nm光激發(fā)時(shí)，易發(fā)出更多的光，因?yàn)殁}沒(méi)有結(jié)合；接著在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前調(diào)整相機(jī)設(shè)置以優(yōu)化動(dòng)態(tài)范圍，在每個(gè)波長(zhǎng)采集一個(gè)圖像，然后使用感興趣區(qū)域或ROI工具來(lái)測(cè)量每個(gè)波長(zhǎng)的背景強(qiáng)度，將背景值輸入到控制軟件中以便背景值能夠從隨后的圖像中減去。初始設(shè)置完成后，選擇五個(gè)左右的室區(qū)成像，并在控制軟件中保持相應(yīng)的參數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，顯微鏡自動(dòng)平臺(tái)移動(dòng)到一個(gè)區(qū)域中，采集在340和380nm的波長(zhǎng)光激發(fā)下的熒光比例，然后移動(dòng)到下一個(gè)區(qū)域，直到所有的區(qū)域都被采集完。在有些實(shí)驗(yàn)中，藥理學(xué)試劑被加到灌流液中，引起細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化，高鉀溶液能使神經(jīng)元去極化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升，如圖中這一系列延時(shí)拍攝的圖像，就是一個(gè)很好的陽(yáng)性對(duì)照。

預(yù)采集完成，我們就開(kāi)始分析，要分析結(jié)果，我們先用軟件選擇包括神經(jīng)元、或神經(jīng)元部分結(jié)構(gòu)的感興趣區(qū)域ROI區(qū)域。接下來(lái)，使用該軟件在所有收集到的圖像上測(cè)量每個(gè)ROI區(qū)域兩種波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度比率，有了這個(gè)信息就可以定量評(píng)估細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨時(shí)間的變化。

Applications

現(xiàn)在，你已經(jīng)了解了如何對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像，讓我們來(lái)看看這種很有價(jià)值的方法在今天的一些科學(xué)研究中的應(yīng)用。

首先，鈣成像用于研究與神經(jīng)活動(dòng)有關(guān)的胞內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)，在這個(gè)研究中單個(gè)神經(jīng)元被導(dǎo)入一種鈣指示劑染料并同時(shí)進(jìn)行膜片鉗記錄，通過(guò)膜片鉗技術(shù)精確控制膜電位，從而觀察鈣流動(dòng)態(tài)。

鈣成像使研究人員能夠研究神經(jīng)元的高度同步網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，這里，神經(jīng)科學(xué)家使用鈣成像來(lái)檢測(cè)40個(gè)神經(jīng)元的熒光信號(hào)。有了這個(gè)信息，就可以確定信號(hào)傳播、神經(jīng)關(guān)系等網(wǎng)絡(luò)特性。

鈣動(dòng)力學(xué)也可揭示神經(jīng)元是如何處理來(lái)自外界的信號(hào)，如氣味。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，組織內(nèi)的神經(jīng)元與Fura-2孵育，并在有類似尿液氣味或純化的信息素存在時(shí)進(jìn)行成像，通過(guò)操縱嗅覺(jué)神經(jīng)元上氣味受體蛋白的表達(dá)就可能直接可視化研究單個(gè)蛋白如何影響細(xì)胞對(duì)獨(dú)特氣味做出反應(yīng)的能力。

您剛觀看的是Jove對(duì)神經(jīng)元鈣成像的介紹。本短片中我們討論了這項(xiàng)技術(shù)的特性，回顧了一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)。由于鈣具有許多重要功能，鈣成像將持續(xù)作為了解神經(jīng)元及其如何相互作用的重要工具