骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的另一類非常?重要的成體間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，具有支持和調(diào)控造血的作用，能被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)技術(shù)

?一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備??

實(shí)驗(yàn)開始前，將眼科剪刀、眼科鑷子、培養(yǎng)皿，15ml 離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30min。

1. 選取 SPF 級，體重 100~150g 左右的SD 大鼠，斷頸處死。將大鼠置于體積分?jǐn)?shù)為 75%的乙醇中浸泡 5 min。

2. 工作臺紫外消毒后，采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3min。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。

3. 無菌條件下，準(zhǔn)備好大剪刀、止血鉗、眼科剪刀、眼科鑷子、干凈培養(yǎng)皿。將大鼠仰臥在超凈臺內(nèi)的干凈培養(yǎng)皿上。

二、全骨髓提取?

1. 眼科鑷沿腹股溝處提拉大鼠皮膚，眼科剪刀剪開腹股溝皮膚，暴露腿部肌肉，從關(guān)節(jié)處將大鼠大腿剪下。除去骨表面附著的軟組織，置于另一無菌培養(yǎng)皿中。

2. 假如在平時操作中，剪刀不易將骨表面肌肉組織剔除干凈，可采用無菌紗布擦拭，可方便的將肌肉組織剔除干凈，提高所分離細(xì)胞的純度。

3. 用無菌PBS 浸泡清洗。眼科剪剪斷兩端骨骺，顯露骨髓腔，放置于 10ml 含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的新鮮DMEM 完全培養(yǎng)液的無菌培養(yǎng)皿中，取出 1mL 注射器，用鑷子鉗起骨頭的一端，并用注射器吸取完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔至另一培養(yǎng)皿中，由一段骨髓腔沖出骨髓，?重復(fù) 3 次，再反方向沖出骨髓，重復(fù) 3 次。直至骨髓腔沖洗液變清亮后停止。

三、細(xì)胞制備??

吹打細(xì)胞懸液，以便分散細(xì)胞，收集骨髓懸液于 15 mL 離心管中，1000 r/min 室溫離心5 min。

四、接種培養(yǎng)?

1.?離心后去上清，用?6mL?完全培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打，制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至?25?cm2.?培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻;置于?37?℃、體積分?jǐn)?shù)為?5%的?CO2?飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3. 24 小時后，鏡下觀察，可見細(xì)胞濃度極大，全為球形的大鼠骨髓中的血紅細(xì)胞，如堆積的沙粒狀，懸浮于培養(yǎng)液中并有少量血紅細(xì)胞相互聚集發(fā)生。換液，去除漂浮的血細(xì)胞，?以后每兩三天換液 1 次，直到增殖達(dá)到融合。4. 約 7 天后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長情況，可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，融合達(dá) 80%~90%，可進(jìn)行細(xì)胞傳代。

五、細(xì)胞傳代??

待細(xì)胞融合至 80%~90%開始傳代，吸去培養(yǎng)液，以預(yù)熱的 PBS 輕輕沖洗后，吸去 PBS。采用消化液消化 1-2 分鐘，骨髓干細(xì)胞貼壁特性強(qiáng)，比較難于消化，消化液可采用提高EDTA 濃度的方法，鏡下可見細(xì)胞皺縮變圓，終止消化。本實(shí)驗(yàn)的消化液配方可以很好地消化，并不會損傷細(xì)胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盤內(nèi)的細(xì)胞傳代方法?！　?/p>

本實(shí)驗(yàn)以 1：2 進(jìn)行傳代?！　?/p>

六、細(xì)胞觀察　

細(xì)胞傳代到第 3 代時，生長融合后，細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形集落樣分布，并可重疊生長，細(xì)胞純度可達(dá) 95%以上。此時細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或采用表表面標(biāo)志物進(jìn)一步驗(yàn)證其純度：驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)為CD34 陰性，CD44 陽性?！　谋緦?shí)驗(yàn)結(jié)果中可見：全骨髓培養(yǎng)法可分離培養(yǎng)出純度高、活力旺盛的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

七、注意事項(xiàng)??

1. 緩慢沖洗骨髓腔：　　沖洗骨髓腔時為了避免沖起許多氣泡損傷細(xì)胞，應(yīng)緩慢沖洗。

2. 嚴(yán)格無菌：　　取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的整個過程都需要謹(jǐn)慎，保證無菌操作

3. 培養(yǎng)基中血清濃度：　　過多的血清中細(xì)胞因子可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但細(xì)胞老化也快。而且一般來說，選擇質(zhì)量好 10%的胎牛血清有利于 MSCs 的培養(yǎng)

4. 原代細(xì)胞靜置培養(yǎng)：　　原代細(xì)胞置于培養(yǎng)箱 24～48h 內(nèi)，應(yīng)處于靜置狀態(tài)，不宜取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁。

作者：海星生物

公眾號：Cas9X細(xì)胞基因敲除

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