癌癥基因組記錄了正常細(xì)胞發(fā)育和癌變過(guò)程中 DNA 損傷和 DNA 修復(fù)缺陷引起的基因改變。BRCA1缺陷型（BRCA1d）和BRCA2缺陷型（BRCA2d）癌癥的全基因組體細(xì)胞改變模式歸因于HR的缺陷，HR是人類(lèi)細(xì)胞修復(fù)雙鏈斷裂（DSB）的主要途徑。其中一些突變模式可能反映了細(xì)胞在缺乏 HR 的情況下使用的特定易出錯(cuò)的 DSB 修復(fù)機(jī)制。這種突變模式可作為 HR 缺乏的生物標(biāo)志物，并有助于識(shí)別臨床相關(guān)的治療缺陷。

2023年8月16日，發(fā)表在《Nature》雜志上的一篇題為“Long-molecule scars of backup DNA repair in BRCA1- and BRCA2-deficient cancers”的文章，揭示了BRCA1或BRCA2缺陷所特有的重排類(lèi)別可能是HR缺陷細(xì)胞中細(xì)胞遺傳畸變的來(lái)源。

現(xiàn)漢恒有BRCA1相關(guān)基因產(chǎn)品，超值限量活動(dòng)！

典型的互變重排（即平衡易位或倒位）不會(huì)導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的丟失或增殖。許多重排，包括易位和倒位，斷裂末端在基因組上靠近但不相鄰。TICs和chromoplexies（平衡重排鏈）是近乎對(duì)等的復(fù)雜 SVs （structural variants，結(jié)構(gòu)變異）的例子。近對(duì)等 SV 包含中間基因組區(qū)域的拷貝缺失或增益，被稱(chēng)之為空白區(qū)段。根據(jù)質(zhì)量守恒，當(dāng)斷裂末端連接到間隙區(qū)段（+極性）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)增加；當(dāng)斷裂末端連接到側(cè)翼區(qū)段（-極性）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)減少。對(duì)于（+）間隙區(qū)段，相同的基因座拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和拷貝數(shù)特征可能與易位或簡(jiǎn)單的模板插入同樣一致，在易位或模板插入中，間隙區(qū)段被拷貝到遠(yuǎn)處的基因座上，而源基因座則未被拷貝。對(duì)相互對(duì)（reciprocal pairs）的間隙段長(zhǎng)度和極性進(jìn)行可視化后，發(fā)現(xiàn)了三種不同的亞模式，它們是 BRCA1 缺乏癥和/或 BRCA2 缺乏癥所特有的。首先，在 BRCA1d 腫瘤中，具有兩個(gè) 100-bp-100-kbp (+) 極性間隙片段的互變對(duì)富集，被稱(chēng)之為互變重復(fù)（rDups）。其次，在 BRCA2d 腫瘤中，具有兩個(gè) 1-bp-10-kbp (-) 缺口片段的互變對(duì)富集，被稱(chēng)之為互變?nèi)笔В╮Dels）。第三種情況是，在 BRCA1d 和 BRCA2d 病例中，由 1-bp-100-kbp 的極性相反（+）和（-）的間隙片段組成的互補(bǔ)對(duì)富集，被稱(chēng)之為互補(bǔ)缺失重復(fù)（rDelDups）。對(duì)單個(gè)互變配對(duì)位點(diǎn)的檢測(cè)證實(shí)，這些相互對(duì)發(fā)生在基因組區(qū)域，而這些區(qū)域在 1-Mbp 范圍內(nèi)并不包含其他重排。在驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中分析這些模式證實(shí)，rDups、rDels 和 rDelDups 分別在 BRCA1、BRCA2 和 HR 缺陷中富集。

圖1. 在 BRCA1d 和 BRCA2d 腫瘤中富集了相互對(duì)（reciprocal pairs）

接下來(lái)，為了評(píng)估相互對(duì)是否可能導(dǎo)致 HRD 癌癥中的大規(guī)模重排，作者推斷了它們的衍生染色體結(jié)構(gòu)，即相位。這些分析的具體目標(biāo)是根據(jù) LR WGS 配對(duì)模式區(qū)分順式（復(fù)制粘貼、模板插入）結(jié)果和反式（平衡易位或倒位）結(jié)果。在對(duì)基因定相進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試后，作者分析了 LR WGS 數(shù)據(jù)中的相互對(duì)。對(duì) BRCA1d 樣本中的 94 個(gè) rDups 進(jìn)行相位分析后發(fā)現(xiàn)，順式相位占絕大多數(shù)（67/94；71%），每一個(gè)結(jié)果都是在遠(yuǎn)處基因座的串聯(lián)重復(fù)間隙片段之間復(fù)制和粘貼一個(gè)間隙片段。例如，給定 ABC 和 DEF 這兩個(gè)基因座，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè) ABEBC 單倍型，其中包含串聯(lián)的變異 BE 和 EB 連接，而另一個(gè) DEF 單倍型則未進(jìn)行排列。其余 29% 的基因座包含反式結(jié)構(gòu)，其中 BE 和 EB 連接點(diǎn)位于不相連（染色體間 rDups）或相距較遠(yuǎn)（染色體內(nèi) rDups）的重排等位基因上。在這些結(jié)果中，兩個(gè)不同的衍生等位基因 ABEF 和 DEBC 共享重復(fù)的 B 和 E 段。這包括平衡易位，在交界處有多達(dá)約 20 kbp 的重復(fù)序列。同樣，使用 LR WGS 對(duì) 37 例 HRD（22 例 BRCA1d，14 例 BRCA2d，1 例 BRCA1d 和 BRCA2d）中的 46 個(gè) rDelDups 進(jìn)行了分期。與 rDups 一樣，在不同的基因位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了順式和反式相位，盡管在 BRCA1d 腫瘤中反式相位占優(yōu)勢(shì)，比例約為 2:1，而在 BRCA2d 腫瘤中順式相位占優(yōu)勢(shì)，比例約為 4:1。就 ABC 和 DEF 基因座而言，順式 rDelDups 包括 "剪切、復(fù)制和粘貼 "的結(jié)果，即在一個(gè)衍生的 AEC 等位基因上用一個(gè)額外的 E 拷貝取代了 B 拷貝，而一個(gè)未排列的 DEF 基因座包含了另一個(gè) E 拷貝；相比之下，反式基因座顯示相同（1-241 kbp）的 E 片段在兩個(gè)不同的 DEC 和 AEF 衍生基因座上重復(fù)。最后，短讀數(shù)預(yù)測(cè) BRCA2d 腫瘤特異性 rDels 會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)格的反式結(jié)果，LR WGS 證實(shí)了這一點(diǎn)。這些結(jié)果表明，反式相互對(duì)在 rDups、rDels 和 rDelDups 中很常見(jiàn)，是 BRCA1d 和 BRCA2d 腫瘤中大規(guī)模重排的來(lái)源。

圖2. LR WGS 揭示了類(lèi)似相互對(duì)拓?fù)涞捻樖胶头词较辔?/p>

鑒于順式和反式相互對(duì)的染色體結(jié)果不同，作者尋找能在短讀 WGS 中區(qū)分這些位點(diǎn)的特征，從而能在更大的數(shù)據(jù)集中研究相互對(duì)的相位。對(duì)順式 rDups 的相位結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析和可視化后發(fā)現(xiàn)，短（50 bp-1 kbp）E 段主要以 ABEBC 結(jié)構(gòu)交錯(cuò)于長(zhǎng)（1-300 kbp）B 段的兩個(gè)拷貝之間。然而，在 ABEF 和 DEBC 單倍型中，反式 rDups 由一對(duì)較長(zhǎng)（1 kbp-300 kbp）的 B 和 E 片段組成。將這些 LR WGS 相位順式和反式位點(diǎn)與來(lái)自短讀數(shù) WGS BOPP 數(shù)據(jù)集的非相位數(shù)據(jù)繪制成圖，以每對(duì)中較長(zhǎng)的間隙段長(zhǎng)度為方向（y 軸），發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的 rDup 群。第一個(gè) "長(zhǎng)-短 "rDup 群涉及較長(zhǎng)（1-100 kbp）和較短（10 bp-1 kbp）間隙片段的連接，完全由順式事件組成。相比之下，反式 rDups 完全包含在第二個(gè) "長(zhǎng)-長(zhǎng) "群中。發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的長(zhǎng)度差異可以區(qū)分順式和反式 rDelDups。這些長(zhǎng)度差異使得在短讀數(shù) WGS 中以合理的精度推算相互對(duì)相位成為可能。由于反式相互對(duì)可能產(chǎn)生長(zhǎng)程 SV（例如平衡易位和倒位），預(yù)測(cè)反式事件（而非順式事件）的染色體方向會(huì)受到限制。具體來(lái)說(shuō)，反式相互對(duì)可能出現(xiàn)在兩種中心粒定向之一：第一種（I 型）定向只產(chǎn)生單中心染色體，而第二種（II 型）定向產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)異中心衍生物。由于無(wú)著絲粒 DNA 片段容易在隨后的細(xì)胞分裂中丟失，因此無(wú)著絲粒片段上的連接點(diǎn)會(huì)優(yōu)先丟失，而剩余的連接點(diǎn)不會(huì)被檢測(cè)為相互對(duì)。這將導(dǎo)致反式相互對(duì)的 I 型偏倚。相反，由于模板插入不會(huì)改變?nèi)旧w中心粒的劑量，因此順式基因座應(yīng)該與 I 型和 II 型取向無(wú)關(guān)。事實(shí)上，當(dāng)分析 LR WGS 的分期數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)反式基因座對(duì) I 型和 II 型的偏倚超過(guò) 9:1，而順式基因座同樣有可能處于 I 型或 II 型方向（P = 3.9 × 10-6，幾率比（OR）= 8.57，費(fèi)雪精確檢驗(yàn)）。接下來(lái)，作者分析了短讀數(shù) WGS BOPP 數(shù)據(jù)集中的無(wú)相位相互對(duì)，根據(jù)大小和方向推算順式和反式相位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)具有相同的偏倚方向（P = 1.4 × 10-4，OR = 1.96），盡管這些數(shù)據(jù)僅有歸因相位。特別是，這些分析表明，染色體內(nèi)反式相互對(duì)產(chǎn)生的巨堿基規(guī)模倒位同樣受到中心粒劑量的限制。反式相互對(duì)預(yù)測(cè)會(huì)出現(xiàn)的間期和端粒缺失的大小分布反映了在HRD癌癥中發(fā)現(xiàn)的間期和端粒LOH的分布。這些結(jié)果共同表明，反式相互對(duì)具有大規(guī)模染色體后果，因此可能與細(xì)胞遺傳學(xué)上可見(jiàn)的畸變有關(guān)，而這些畸變通常與 BRCA1 和 BRCA2 失活有關(guān)。

圖3. 異常復(fù)制-重啟模型將反式相互對(duì)與巨堿基規(guī)模的染色體改變聯(lián)系起來(lái)

鑒于LR WGS 數(shù)據(jù)，作者認(rèn)為可以利用長(zhǎng)分子圖譜檢測(cè) HR 缺失特異性修復(fù)途徑的其他疤痕。單鏈退火（SSA）是一種DSB修復(fù)途徑，涉及DSB側(cè)翼近似同源（同源）重復(fù)序列的雜交。HR 缺乏的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)顯示，SSA 在 BRCA2d 癌癥中是活躍的，但在 BRCA1d 癌癥中并不活躍。在切除斷裂末端深處退火相似序列時(shí)，SSA 能允許低至 80% 的序列同一性；然而，以前對(duì) HR 缺乏癥的基因組研究只分析了精確的微同源性，而沒(méi)有檢查不精確的序列同一性。為了更好地評(píng)估 LR WGS 圖譜中的 SSA ，作者開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種算法，用于檢測(cè)體細(xì)胞斷裂末端附近的同源運(yùn)行或 80% 或更高的序列同一性。該算法確定了 50 bp 左右的同源峰值，在 46 個(gè) LR WGS 樣本中發(fā)現(xiàn)了 138 個(gè)同源度大于 10 bp 的連接點(diǎn)。值得注意的是，這些同源連接大多也能在短讀程 WGS 中高效檢測(cè)到，這表明同源分析可應(yīng)用于完整的短讀程 WGS BOPP 數(shù)據(jù)集。對(duì) 583 對(duì)腫瘤-正常人配對(duì)（BRCA1d、BRCA2d 或 HRP）的分析表明，49,561 個(gè)連接點(diǎn)中有 1,248 個(gè)（2.5%）是同源的，其分布情況與 LR WGS 相似。雖然這些連接的同源長(zhǎng)度中位數(shù)為 40 bp，但觀察到的連接束長(zhǎng)達(dá) 128 bp。接下來(lái)，作者研究了哪些類(lèi)別的簡(jiǎn)單或復(fù)雜變異包含同源連接。比較不同基因型的分布發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于 BRCA1d（RR = 3.93，P = 4.2 × 10-4，伽馬-泊松回歸的 Wald 檢驗(yàn)）和 HRP 癌癥（RR = 3.28，P = 8.37 × 10-6，伽馬-泊松回歸的 Wald 檢驗(yàn)），BRCA2d 癌癥中較大（超過(guò) 1 kbp）同源缺失的負(fù)擔(dān)和比例明顯更高。盡管在其他 SV 類(lèi)中也觀察到了同源斷裂末端，但這些事件的負(fù)擔(dān)與 HR 缺陷狀態(tài)無(wú)關(guān)。值得注意的是，同源缺失的中位大小與已知發(fā)生在 BRCA2d 細(xì)胞中的末端切除長(zhǎng)度一致31,32，支持 SSA 在人類(lèi) BRCA2d 腫瘤中作為后備修復(fù)途徑的作用。

圖4. LR WGS 在 BRCA2d 基因組中發(fā)現(xiàn)了 SSA 的足跡

最后，作者思考了僅根據(jù)斷點(diǎn)級(jí)結(jié)構(gòu)基因組特征預(yù)測(cè)HR缺陷的效果如何？為了評(píng)估這一點(diǎn)，作者比較了僅使用 HRDetect 中 SV 特征（RS3 和 RS5 標(biāo)志）訓(xùn)練的隨機(jī)森林分類(lèi)器和使用 B1+2 特有的附加 SV 特征（同源缺失、互對(duì)和 1-100-kbp 簡(jiǎn)單重復(fù)）訓(xùn)練的隨機(jī)森林分類(lèi)器的性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與基于 HRDetect 的 SV 分類(lèi)器（AUROC = 0.73，AUPRC = 0.57）相比，基于 B1+2 的 SV 分類(lèi)器（AUROC = 0.93，AUPRC = 0.57，泛癌 HMF）的性能要好得多（P < 2.2 × 10-16，DeLong 檢驗(yàn)）。雖然某些 B1+2 分類(lèi)器特有的 SV 特征單獨(dú)使用時(shí)具有相關(guān)性，但當(dāng)這些特征結(jié)合使用時(shí)，觀察到的性能最高。接下來(lái)作者研究了 B1+2 是否能區(qū)分 BRCA1 和 BRCA2 缺乏癥，這兩種疾病是不同的生物狀態(tài)，各自可能有不同的治療缺點(diǎn)。由于 HRDetect 并非為解決這一任務(wù)而開(kāi)發(fā)，將 B1+2 與根據(jù) HRDetect 的六個(gè)特征訓(xùn)練的隨機(jī)森林分類(lèi)器進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn) B1+2 在區(qū)分 BRCA1d 和 BRCA2d 腫瘤方面的表現(xiàn)（AUROC = 0.90，AUPRC = 0.91）大大優(yōu)于這種類(lèi)似 HRDetect 的分類(lèi)器（AUROC = 0.80，AUPRC = 0.83）（P = 0.005，DeLong 檢驗(yàn)）。B1+2 分類(lèi)器特異性 SV 特征對(duì)于區(qū)分非 BOPP 癌癥尤為重要。由于 B1+2 可分別輸出 BRCA1d（B1 得分）和 BRCA2d（B2 得分）的概率，因此可以分析分類(lèi)器稱(chēng)為 HR 缺乏的腫瘤（B1+2 陽(yáng)性，B1 + B2 得分 > 0.5）中 BRCA1d 或 BRCA2d 的概率。這項(xiàng)分析證實(shí)，相對(duì)于乳腺癌和卵巢癌，前列腺癌和胰腺癌的 HR 缺失明顯富集于 BRCA2d 表型，而在乳腺癌和卵巢癌中，BRCA1 和 BRCA2 缺失的可能性相同。HR缺陷基因組特征的一個(gè)主要用途是發(fā)現(xiàn)HR通路失活的替代機(jī)制，并評(píng)估意義不確定變體（VUS）的致病性。對(duì)訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)中排除的病例的 B1+2 評(píng)分分布進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各層次的單拷貝和/或 VUS 病例中，B1+2 陽(yáng)性率明顯較高。盡管這一比例大大低于 BRCA1 或 BRCA2 雙倍性致病性改變的病例（95%）。這包括對(duì) BRCA1d（BARD1 和 EME1）和 BRCA2d（PALB2 和 RAD51C）具有不同偏倚的基因，這與它們?cè)?HR 通路中的已知作用一致。這些結(jié)果表明，B1+2 分類(lèi)器有助于發(fā)現(xiàn)和亞分類(lèi)導(dǎo)致 HR 缺乏的致病等位基因。

圖5. 區(qū)別 BRCA1 和 BRCA2 缺乏癥的 SV 特征

總之，本研究通過(guò)對(duì)數(shù)千例腫瘤的短線程全基因組測(cè)序（WGS）圖譜的基因組圖譜分析與對(duì) 46 例 BRCA1 或 BRCA2 突變?nèi)橄侔┑纳疃孺溩x測(cè)序 WGS 分析相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)不同的HR缺陷富集重排，稱(chēng)為相互對(duì)，其是HR缺陷中的疤痕類(lèi)型，而這些疤痕來(lái)自于兩種備用的修復(fù)機(jī)制，可能促使HR缺陷的癌細(xì)胞存活，而阻斷這一機(jī)制或許是治療這些癌癥的一種新方法。