細(xì)胞凋亡這一概念最早在1972年由J.F.R.Kerr等人在研究組織變化時(shí)提出的（KerrJFR等，1972）。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序化死亡，是指細(xì)胞受到特定的細(xì)胞內(nèi)信號或細(xì)胞外信號的誘導(dǎo)刺激，激活下游的死亡途徑，在基因的調(diào)控下進(jìn)行的一系列的細(xì)胞死亡過程。細(xì)胞凋亡對生物生長發(fā)育、傷口愈合等過程具有至關(guān)重要的意義。

細(xì)胞死亡方式的另一種方式被稱為細(xì)胞壞死，但是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死具有截然不同的特征，細(xì)胞凋亡是一種主動的生理反應(yīng)，細(xì)胞壞死則是細(xì)胞對嚴(yán)重?fù)p傷的一種被動反應(yīng)和變性過程。凋亡過程受細(xì)胞內(nèi)一系列相關(guān)的分子所調(diào)控，涉及一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，并伴隨有典型的形態(tài)學(xué)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞的解體。凋亡細(xì)胞的許多形態(tài)學(xué)改變是特征性的，甚至是唯一與凋亡相關(guān)的，因此可以作為檢測凋亡的基礎(chǔ)。凋亡檢測的關(guān)鍵是將凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞以及壞死細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的區(qū)分。

No.1

凋亡的程序性死亡特點(diǎn)

1. 染色質(zhì)聚集、分塊、位于核膜上，胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂，細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體；
   

2. 凋亡小體內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體，可被鄰近細(xì)胞吞噬消化，因始終有膜封閉，沒有內(nèi)溶物釋放，故不會引起炎癥；

3. 凋亡細(xì)胞中仍需要合成一些蛋白質(zhì)；

4. 核酸內(nèi)切酶活化，導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成約180-200bp整數(shù)倍的核酸片段，凝膠電泳圖譜呈梯狀；

5. 凋亡通常是生理性變化。
   

No.2

細(xì)胞凋亡的過程及標(biāo)志

一

?細(xì)胞凋亡過程

細(xì)胞凋亡過程及形態(tài)的改變根據(jù)細(xì)胞凋亡過程中的形態(tài)學(xué)特征變化，將細(xì)胞凋亡分為3個(gè)過程：

01

?凋亡起始階段：

細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)消失;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔腫脹變大，線粒體膨大;細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂;染色質(zhì)凝縮分布在核膜一側(cè)或周圍;胞質(zhì)出現(xiàn)大小不均的空泡。

02

?凋亡小體形成階段：

染色質(zhì)進(jìn)一步凝縮并斷裂為大小不均一的片段，DNA發(fā)生斷裂，細(xì)胞核解體，細(xì)胞質(zhì)膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹著斷裂的DNA和破碎的細(xì)胞器通形成許多球形小泡，這些有膜包圍的小泡被稱為凋亡小體。

03

?吞噬清除階段：

凋亡小體形成后，被巨噬細(xì)胞和鄰近的細(xì)胞識別并吞噬消化。

二

?細(xì)胞凋亡的生物化學(xué)變化

細(xì)胞凋亡時(shí)不僅發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時(shí)也伴隨著許多生物化學(xué)變化的發(fā)生。比較明顯的生物化學(xué)變化有以下幾種：

1. 細(xì)胞質(zhì)膜上磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)。

2. 線粒體內(nèi)膜喪失膜電位。

3. DNA被隨機(jī)切成大小不均一的片段。

4. 凋亡相關(guān)蛋白的激活：包括Bcl-2家族蛋白、細(xì)胞色素c、Caspase家族蛋白等凋亡相關(guān)蛋白的激活。

No.3

細(xì)胞凋亡信號通路及相關(guān)因子

細(xì)胞凋亡通過信號傳導(dǎo)通路發(fā)生，有序而不失節(jié)奏的經(jīng)歷著啟動、進(jìn)行、結(jié)束的過程。每條傳導(dǎo)通路由于受到重要因子的精準(zhǔn)調(diào)控，天生兼具復(fù)雜而獨(dú)特的機(jī)制與氣質(zhì)。

介導(dǎo)凋亡的信號通路主要可分為3大類，分別是線粒體通路、死亡受體通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。各通路間相互作用、互相聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)凋亡過程，每條通路中包含不同的實(shí)現(xiàn)途徑。

一、線粒體通路

線粒體通路

01

?Cyt C途徑

線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，Cyt C作為關(guān)鍵性分子，是胞核基因編碼的蛋白質(zhì)，其釋放介導(dǎo)的凋亡途徑與Bcl-2家族成員的調(diào)節(jié)控制有關(guān)。

受到凋亡刺激后（如：DNA的損傷、生長因子缺乏等），引起B(yǎng)ax/Bak形成低聚物復(fù)合體，插入到線粒體外膜孔隙，導(dǎo)致線粒體滲透壓改變，跨膜電位丟失，促使Cyt C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，并與細(xì)胞凋亡激活因子1（Apaf-1）結(jié)合形成凋亡復(fù)合體，活化Caspase-9前體，進(jìn)而激活Caspase-3和Caspase-7，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。期間，Smac、Omi和ARTS等其他促凋亡蛋白抑制IAPs，共同促進(jìn)凋亡反應(yīng)。

02

?PTP通道

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）鑲嵌在線粒體內(nèi)膜和外膜之間，介導(dǎo)形成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP），可以無選擇性地允許≤1.5 kD分子通過，當(dāng)線粒體基質(zhì)內(nèi)處于高滲透壓時(shí)，通道開放引起凋亡。

二、死亡受體通路

死亡受體通路

死亡受體（DR）包括多種分子，均屬腫瘤壞死因子受體TNFR基因超家族。目前已知的死亡受體有5種，TNFR-1、Fas（CD95）、DR3、TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）。

01

?Fas/FasL和TRAILR/TRAIL途徑

作為腫瘤壞死因子TNF家族促凋亡成員，F(xiàn)asL和TRAIL分別與死亡受體Fas（CD95）、TRAIL-R1（DR4）或TRAIL-R2（DR5）結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（DISC），DISC包含接頭分子FADD和Caspase-8酶原，Caspase-8酶原自我剪切形成活性Caspase-8，啟動下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)。

其次，活化的Caspase-8能夠切割Bcl-2家族促凋亡蛋白Bid，產(chǎn)生的帶羧基片段tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，與線粒體膜結(jié)合引起線粒體釋放Cyt C等促凋亡物質(zhì)，引發(fā)凋亡反應(yīng)。

02

?TNFR1/TNF途徑

在TNFR-1介導(dǎo)的凋亡通路中，三聚化的TNFR-1募集接頭蛋白TRADD，TRADD通過自身的DD可匯聚FADD、RIP和TRAF-2。這里分2條通路：

1. 當(dāng)結(jié)合的是FADD，便導(dǎo)致Caspase-8前體寡聚化，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)和凋亡；

2. 當(dāng)結(jié)合的是RIP，便激活TRAF-2，形成TRADD-RIP-TRAF-2復(fù)合物，通過磷酸化進(jìn)一步激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK），NIK活化IκB激酶（IKK），IKK磷酸化IκB，導(dǎo)致NF-κB的降解和釋放，NF-κB轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的作用，主要激活一些抗凋亡基因如c-IAP1等的轉(zhuǎn)錄，繼而通過抑制caspase-8的活化等途徑發(fā)揮抗凋亡作用。

因此，TNFR可能參與凋亡和抗凋亡兩種截然相反的信號途徑。TNFR通路活化后，細(xì)胞的發(fā)展方向取決于雙方的信號水平強(qiáng)弱等因素。

三、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞中負(fù)責(zé)蛋白的合成、加工和修飾。在病毒感染、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等的情況下，致使非折疊蛋白的累積和聚集，導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ER stress）。越來越多的研究顯示，持續(xù)的ER stress大多來源于非折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）狀態(tài)的改變。

01

?IRE1信號通路

UPR條件下，IRE1-JNK幫助細(xì)胞自救，是重要的信號通路。一方面，IRE1活性運(yùn)動可切割XBP-1 mRNA，使它成為有效的轉(zhuǎn)錄激活因子，誘導(dǎo)蛋白基因轉(zhuǎn)錄，編碼ER分子伴侶，緩解ER壓力。另一方面，IRE1可結(jié)合TRAF2，通過激酶活性增加ER stress，在ASK1存在條件下，激活JNK。持續(xù)的ER stress使得IRE1募集TRAF2，激活A(yù)SK和JNK的蛋白激酶，啟動凋亡級聯(lián)。

02

?PERK信號通路

ER stress增加PERK蛋白激酶活性，PERK磷酸化elF2，抑制蛋白翻譯和合成，緩解ER壓力。同時(shí)，elF2的磷酸化能夠選擇性地啟動ATF4翻譯，增加其結(jié)合配體的合成，影響氨基酸代謝，從而抑制蛋白的翻譯和合成。

正常情況下，CHOP在細(xì)胞質(zhì)中維持低水平表達(dá)。當(dāng)ER stress發(fā)生時(shí)，Bip/GRp78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、ATF6等的解離均能激活CHOP。

CHOP誘導(dǎo)凋亡蛋白（如：GADD34、ERO1、DR5）的表達(dá)，可直接激活GADD34，促進(jìn)ER下游蛋白的生物合成。實(shí)驗(yàn)顯示，氧化酶ERO1a很可能在二硫鍵形成過程中介導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)失敗或持續(xù)性壓力。因此，CHOP的過度表達(dá)能夠?qū)е禄钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生，引發(fā)ER stress，介導(dǎo)凋亡。同時(shí)，CHOP的大量表達(dá)，也可引起B(yǎng)cl-2表達(dá)的下降，導(dǎo)致Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，啟動線粒體凋亡通路。

四、Ca2+途徑

Ca2+途徑

在體內(nèi)，Ca2+濃度對維持線粒體膜的通透性起著重要作用，線粒體內(nèi)鈣離子濃度的上升會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而釋放Cyt C，誘導(dǎo)凋亡。

Ca2+也可維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，并且調(diào)控了大量的酶反應(yīng)。其正常狀態(tài)的改變可引發(fā)ER stress，開啟JNK通路，刺激Bax活化。除此之外，Ca2+能夠調(diào)節(jié)Calpain，Calpain切割Bax N端，產(chǎn)生促凋亡片段，可促進(jìn)凋亡反應(yīng)。

No.4

細(xì)胞凋亡檢測方法

在生物學(xué)研究過程中常常需要檢測細(xì)胞凋亡情況。目前至少有十?dāng)?shù)種檢測細(xì)胞凋亡的方法，大致可分為基于細(xì)胞形態(tài)、生物學(xué)功能和生化標(biāo)記三大類。每一方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)實(shí)際情況選擇最為適合的方法。

一、基于細(xì)胞形態(tài)的方法

基于細(xì)胞形態(tài)的方法

01

?電子顯微鏡檢測方法：

電鏡檢查是鑒定凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)。

在透射電鏡下，凋亡細(xì)胞體積變小。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei），染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；凋亡晚期出現(xiàn)核解體，產(chǎn)生凋亡小體。

缺點(diǎn)：

無法定量（電鏡一個(gè)視野僅能觀察一兩個(gè)細(xì)胞）

實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣（固定、切片到拍照）

并非所有實(shí)驗(yàn)室都能接觸到電鏡。

02

?細(xì)胞核形態(tài)染色法

相比細(xì)胞凋亡的其他形態(tài)變化，利用熒光染料配合熒光顯微鏡對細(xì)胞核形態(tài)的觀察也是較為直接的指標(biāo)。常用的 DNA 特異性染料有：Hoechst、DAPI以及碘化丙啶(PI)。Hoechst 是與 DNA 特異結(jié)合的活性染料；DAPI 為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色；PI不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來（Annexin-V/PI法）。

二、基于生物學(xué)功能的方法

基于生物學(xué)功能的方法

01

?Annexin-V/PI雙染色法

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于正常細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin V是一種Ca2+依賴磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力。將熒光標(biāo)記（FITC、PE或 biotin）的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測細(xì)胞凋亡的方法

缺點(diǎn)：

制備貼壁細(xì)胞樣品時(shí)，很容易因消化和吹打造成細(xì)胞額外損傷，從而夸大了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增加了數(shù)據(jù)變異度。

凋亡細(xì)胞的本底熒光或非特異染色的特性會增強(qiáng)，導(dǎo)致熒光飄移，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。

02

?線粒體膜電位檢測

線粒體跨膜電位的下降也是凋亡細(xì)胞一個(gè)重要特點(diǎn)，是細(xì)胞凋亡過程中最早發(fā)生的事件（早于核形態(tài)的變化和PS的外翻）。一旦線粒體跨膜電位崩潰，細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。一些親脂性陽離子熒光染料如 Rhodamine 123、DiOC6、JC-1、TMRM等，在線粒體跨膜電位存在的情況下可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，通過熒光顯微鏡觀察其熒光的增強(qiáng)或減弱可反應(yīng)線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。

三、基于生化標(biāo)記方法Caspase-3活性檢測

基于生化標(biāo)記方法Caspase-3活性檢測

Caspase(cysteinyl-aspartic acid proteases)蛋白家族的活化是細(xì)胞凋亡的典型特征，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中具有非常重要的作用。其中Caspase-3作為關(guān)鍵的執(zhí)行分子在細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常細(xì)胞中以酶原形式存在，在凋亡早期被的活化，但在凋亡晚期及死亡細(xì)胞中，Caspase-3活性顯著下降。因此在試驗(yàn)過程中可以通過檢測檢測Caspase剪切體的含量或Caspase的活性來反應(yīng)細(xì)胞凋亡過程。

01

1、DNA損傷檢測

在細(xì)胞凋亡的后期，Caspase會激活Caspase-ActivatedDNase（CAD），切割核小體之間的DNA，形成以180-200bp為單位的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖電泳后形成DNAladder。

缺點(diǎn)：

耗時(shí)，無法定量，以及結(jié)果不穩(wěn)定

02

?DNA片段原位標(biāo)記

細(xì)胞死亡（凋亡或壞死）時(shí)，DNA發(fā)生斷裂。此時(shí)大量的粘性 3'-OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到 DNA 的 3'- 末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測。

缺點(diǎn)：

一般只用于組織切片樣本的研究

不能區(qū)分凋亡與壞死